產(chǎn)品概述

本品為艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗6-His標(biāo)簽多克隆抗體（貨號(hào)：A190-114A），經(jīng)抗原親和純化，以未標(biāo)記形式提供。6-His標(biāo)簽（HHHHHH）是重組蛋白表達(dá)中常用的表位標(biāo)簽之一，廣泛應(yīng)用于蛋白純化與檢測(cè)。本抗體可特異性識(shí)別C端或內(nèi)部插入的六個(gè)連續(xù)組氨酸殘基，適用于酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、免疫細(xì)胞化學(xué)、免疫沉淀及免疫印跡等多種實(shí)驗(yàn)場(chǎng)景，是重組蛋白表達(dá)鑒定和純化監(jiān)測(cè)的實(shí)用工具。

基本規(guī)格參數(shù)

參數(shù) 具體信息

靶標(biāo) 6-His標(biāo)簽（HHHHHH）

應(yīng)用 ELISA, ICC, IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全I(xiàn)gG

自身抗體亞型 IgG

標(biāo)記物 未標(biāo)記

純度 抗原親和純化

濃度 1 mg/ml

保存溫度 2 - 8 °C

有效期 自收貨之日起1年

緩沖液 含0.09%疊氮鈉的磷酸鹽緩沖鹽水

生產(chǎn)與純化工藝

本抗體的生產(chǎn)采用KLH偶聯(lián)6-His多肽作為免疫原。具體流程如下：

1.免疫原制備：將六個(gè)組氨酸組成的合成多肽（HHHHHH）與血藍(lán)蛋白（KLH）偶聯(lián)，增強(qiáng)免疫原性。

2.免疫程序：使用上述偶聯(lián)物對(duì)兔進(jìn)行多次免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生抗6-His標(biāo)簽的抗血清。

3.親和純化：將6-His多肽固定于固相支持介質(zhì)上，通過親和層析從抗血清中特異性分離目標(biāo)抗體。

4.濃度測(cè)定：依據(jù)比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm波長(zhǎng)下的吸光度（A280）為1.4。本品最終濃度為1 mg/ml。

重要限制說明：經(jīng)驗(yàn)證，本抗體不能檢測(cè)所有N端帶有6-His標(biāo)簽的重組蛋白。部分N端標(biāo)簽可能因空間位阻、折疊方式或鄰近氨基酸序列的影響而無法被有效識(shí)別。建議用戶在使用前通過已知陽(yáng)性對(duì)照（如C端或內(nèi)部標(biāo)簽蛋白）確認(rèn)抗體工作狀態(tài)，或在實(shí)驗(yàn)中同時(shí)設(shè)置標(biāo)簽位置已知的對(duì)照樣本。

特異性與交叉反應(yīng)性

本抗體由KLH偶聯(lián)的線性6-His多肽誘導(dǎo)產(chǎn)生，經(jīng)親和純化后對(duì)六個(gè)連續(xù)組氨酸殘基具有高度特異性。無標(biāo)簽蛋白或僅含單個(gè)/兩個(gè)組氨酸的蛋白通常不會(huì)產(chǎn)生交叉反應(yīng)信號(hào)。

識(shí)別偏好：

C端6-His標(biāo)簽：通常識(shí)別良好

內(nèi)部6-His標(biāo)簽：識(shí)別效果取決于具體序列背景

N端6-His標(biāo)簽：部分蛋白可識(shí)別，部分不可識(shí)別（需實(shí)測(cè)驗(yàn)證）

潛在交叉反應(yīng)：天然蛋白中罕見的富含組氨酸區(qū)域可能產(chǎn)生弱交叉反應(yīng)，但發(fā)生率較低。建議在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置未轉(zhuǎn)染或空載體對(duì)照以評(píng)估背景。

產(chǎn)品設(shè)計(jì)原理與生物學(xué)背景

6-His標(biāo)簽是重組蛋白技術(shù)中廣泛使用的親和標(biāo)簽之一。其作用原理基于組氨酸殘基的咪唑側(cè)鏈與固定化金屬離子（如Ni2?、Co2?）之間的配位相互作用，從而通過金屬親和層析（IMAC）實(shí)現(xiàn)高效純化。典型的純化條件使用低濃度咪唑（20-50 mM）去除雜蛋白，高濃度咪唑（250-500 mM）洗脫目標(biāo)蛋白。

本抗體作為檢測(cè)工具，可用于：

驗(yàn)證重組蛋白的表達(dá)和純化效果

監(jiān)測(cè)蛋白純化過程中的流穿、洗脫組分

免疫沉淀富集His標(biāo)簽融合蛋白

細(xì)胞內(nèi)定位研究（ICC）

由于6-His標(biāo)簽分子量小（約0.8 kDa），通常不影響融合蛋白的結(jié)構(gòu)和功能，無需在純化后切除標(biāo)簽，因此成為蛋白研究的s選標(biāo)簽之一。

應(yīng)用與推薦稀釋比例

以下推薦稀釋比例為起始參考值。需注意，并非所有列出的應(yīng)用均已在本實(shí)驗(yàn)室完成具體驗(yàn)證。建議用戶在s次使用時(shí)根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行梯度優(yōu)化。

應(yīng)用 推薦稀釋比例或用量 備注

酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定 1:1000 - 1:30,000 包被酶標(biāo)板時(shí)推薦1:100 - 1:500

免疫細(xì)胞化學(xué) 1:100 - 1:400

免疫沉淀 1 - 4 µg/mg 裂解物 即每毫克總蛋白使用1-4微克抗體

免疫印跡 1:1000 - 1:30,000

免疫印跡（WB）標(biāo)準(zhǔn)操作條件（經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證）：

封閉液和抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶-TBST

一抗孵育：過夜（4°C或室溫）

細(xì)胞裂解液WB的二抗：推薦使用山羊抗兔IgG（H+L）抗體（貨號(hào)A120-101P）

免疫沉淀樣本W(wǎng)B的二抗：推薦使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，并在封閉緩沖液中添加5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020），以避免重鏈交叉信號(hào)干擾（該二抗僅識(shí)別兔IgG輕鏈，不與免疫沉淀中變性的兔IgG重鏈發(fā)生反應(yīng)）

典型應(yīng)用場(chǎng)景：

ELISA：檢測(cè)含有6-His標(biāo)簽的分泌型或純化重組蛋白，常用于定量分析。

免疫印跡：確認(rèn)重組蛋白的表達(dá)水平、分子量及降解情況。

免疫沉淀：從細(xì)胞裂解物中富集6-His標(biāo)簽融合蛋白，用于后續(xù)酶活檢測(cè)或質(zhì)譜分析。

ICC：定位表達(dá)6-His標(biāo)簽融合蛋白的細(xì)胞，評(píng)估轉(zhuǎn)染效率和亞細(xì)胞分布。

使用與保存注意事項(xiàng)

保存條件：請(qǐng)于2-8°C條件下保存，切勿冷凍。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性失效。在指定條件下，自收貨之日起1年內(nèi)穩(wěn)定有效。

防腐劑提示：緩沖液含0.09%疊氮鈉作為抗菌防腐劑。如后續(xù)實(shí)驗(yàn)涉及細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)ΟB氮鈉敏感的HRP偶聯(lián)反應(yīng)，請(qǐng)通過透析或脫鹽柱去除。

稀釋緩沖液建議：除WB使用5%牛奶-TBST外，其他應(yīng)用推薦使用含1% BSA的正常血清稀釋液。避免使用含高濃度咪唑的緩沖液稀釋抗體，因?yàn)檫溥蚩赡芨蓴_抗原-抗體結(jié)合。

陽(yáng)性對(duì)照建議：

已知表達(dá)的6-His標(biāo)簽重組蛋白（建議C端標(biāo)簽對(duì)照）

商業(yè)化的His標(biāo)簽陽(yáng)性對(duì)照裂解物

陰性對(duì)照建議：

未轉(zhuǎn)染或無標(biāo)簽的細(xì)胞裂解物

使用正常兔IgG替代一抗

N端標(biāo)簽檢測(cè)問題排查：

若目標(biāo)蛋白為N端6-His標(biāo)簽且檢測(cè)信號(hào)弱或無信號(hào)，可嘗試以下優(yōu)化：

使用變性條件（如煮沸）充分暴露表位

嘗試更高濃度的抗體（如1:500）

考慮更換識(shí)別N端His標(biāo)簽的專用抗體

通過點(diǎn)印跡或ELISA確認(rèn)抗體活性