一、產(chǎn)品概述

本產(chǎn)品由艾美捷Bethyl Laboratories推出，是一款針對(duì)人KAP-1（TRIM28）蛋白第824位絲氨酸（Ser824）磷酸化形式的特異性兔多克隆抗體（貨號(hào)：A300-767A），經(jīng)抗原親和純化制備。該抗體適用于免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）、免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光（ICC-IF）、免疫組化（IHC）、免疫沉淀（IP）及蛋白質(zhì)印跡（WB）等多種檢測(cè)方法，可同時(shí)識(shí)別人和小鼠來源的靶蛋白，僅供研究使用。

KAP-1（KRAB相關(guān)蛋白1，又稱TIF1β或TRIM28）是RBCC/Trim結(jié)構(gòu)域家族成員，包含RING指結(jié)構(gòu)域、B盒及α螺旋卷曲區(qū)。KAP-1作為共抑制因子，通過與KRAB鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子的KRAB結(jié)構(gòu)域相互作用，招募染色質(zhì)重塑復(fù)合物，介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄沉默。KAP-1 Ser824位點(diǎn)的磷酸化是DNA損傷應(yīng)答中的關(guān)鍵事件，由ATM/ATR激酶催化，調(diào)控KAP-1的轉(zhuǎn)錄抑制活性及染色質(zhì)松弛。該磷酸化修飾廣泛用作DNA損傷應(yīng)答的標(biāo)志物，特別是在電離輻射誘導(dǎo)的損傷研究中。

二、產(chǎn)品規(guī)格

參數(shù) 詳細(xì)信息

靶標(biāo) KAP-1 磷酸化 (Ser824)

反應(yīng)種屬 小鼠， 人

應(yīng)用 ICC， ICC-IF， IHC， IP， WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 完整IgG

免疫原 圍繞絲氨酸824位的磷酸化合成肽

同種型 IgG

偶聯(lián)物 未偶聯(lián)

純度 抗原親和純化

抗原種屬 人

濃度 200 µg/mL

緩沖液 Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA及0.09%疊d化鈉

儲(chǔ)存條件 2–8°C

有效期 自收貨之日起1年

三、靶標(biāo)詳細(xì)信息

3.1 別名

KAP1， KAP-1， KRAB-associated protein 1， KRIP-1， TIF1B， TIF1-beta， RNF96， PPP1R157， E3 SUMO-protein ligase TRIM28， RING-type E3 ubiquitin transferase TIF1-beta， tripartite motif-containing protein 28。

3.2 功能背景

KAP-1是多功能核蛋白，在轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA損傷應(yīng)答中發(fā)揮核心作用：

轉(zhuǎn)錄共抑制：KAP-1通過其N端RBCC結(jié)構(gòu)域與KRAB鋅指蛋白結(jié)合，招募SETDB1組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、NuRD復(fù)合物及HP1蛋白，介導(dǎo)H3K9me3修飾和異染色質(zhì)形成。

DNA損傷應(yīng)答：在DNA雙鏈斷裂發(fā)生后，ATM/ATR激酶磷酸化KAP-1的Ser824位點(diǎn)。磷酸化的KAP-1導(dǎo)致染色質(zhì)局部松弛，便于修復(fù)因子進(jìn)入損傷位點(diǎn)。Ser824磷酸化是DNA損傷的重要標(biāo)志物，其動(dòng)力學(xué)反映損傷響應(yīng)的強(qiáng)弱。

磷酸化調(diào)控：Ser824位于KAP-1的C端PHD結(jié)構(gòu)域與溴結(jié)構(gòu)域之間，磷酸化阻斷KAP-1與HP1的結(jié)合，解除轉(zhuǎn)錄抑制。去磷酸化由PP1磷酸酶介導(dǎo)，恢復(fù)抑制狀態(tài)。

其他功能：KAP-1還參與干細(xì)胞多能性維持、免疫調(diào)節(jié)及腫瘤抑制。

四、抗體制備與純化

4.1 免疫原及表位定位

本抗體采用磷酸化合成肽作為免疫原。該肽段代表人KAP-1蛋白中圍繞第824位絲氨酸的氨基酸序列，該絲氨酸以磷酸化形式存在（參考序列NP_005753.1）。通過使用磷酸化抗原，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性識(shí)別pSer824表位的抗體，與非磷酸化KAP-1或其他磷酸化蛋白的交叉反應(yīng)極低。

4.2 純化方法

抗體通過抗原親和層析純化。將磷酸化合成肽固定于固相載體，使抗血清中的特異性IgG結(jié)合于該磷酸化表位，經(jīng)洗脫獲得高純度抗體。此法確保最終產(chǎn)品中只保留識(shí)別KAP-1 pSer824的抗體分子，保證了嚴(yán)格的特異性。

4.3 濃度測(cè)定

免疫球蛋白濃度采用比爾定律測(cè)定，以1 mg/mL IgG在280 nm下的吸光度（A280）為1.4作為標(biāo)準(zhǔn)。實(shí)測(cè)濃度為200 µg/mL。

4.4 緩沖液與防腐劑

抗體儲(chǔ)存于Tris緩沖鹽水（TBS），含0.1%牛血清白蛋白（BSA）作為穩(wěn)定劑，及0.09%疊d化鈉作為防腐劑。BSA有助于維持低濃度抗體的穩(wěn)定性，減少管壁吸附。注意：疊d化鈉有毒，操作時(shí)請(qǐng)佩戴防護(hù)手套。

五、儲(chǔ)存與穩(wěn)定性

收到產(chǎn)品后，請(qǐng)將抗體置于2–8°C條件下儲(chǔ)存。切勿冷凍，反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性聚集、效價(jià)下降。在推薦的儲(chǔ)存條件下，自收貨之日起1年內(nèi)可保持穩(wěn)定。由于本抗體濃度為200 µg/mL，不建議分裝凍存（低濃度抗體凍存易失活），應(yīng)于2–8°C原管保存，每次取用后立即放回。

六、應(yīng)用指南

以下推薦條件均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，用戶可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行優(yōu)化。所有WB實(shí)驗(yàn)的封閉及抗體稀釋均使用5%脫脂奶粉-TBST緩沖液，一抗孵育推薦4°C過夜。

6.1 蛋白質(zhì)印跡（Western Blot， WB）

推薦稀釋比：1:2000 – 1:10,000

樣本要求：人或小鼠細(xì)胞裂解液。KAP-1分子量約110 kDa。DNA損傷處理（如電離輻射2–10 Gy，回收30分鐘至4小時(shí)；紫外線照射；喜樹堿或依托泊苷處理）可顯著誘導(dǎo)Ser824磷酸化。

裂解液：必須含足量磷酸酶抑制劑（1 mM Na?VO?， 10 mM NaF， 20 mM β-甘油磷酸酯）。

凝膠與轉(zhuǎn)膜：建議6–8% SDS-PAGE或4–12%梯度膠。常規(guī)濕轉(zhuǎn)（100V，90分鐘）。

二抗選擇：

細(xì)胞裂解液WB：使用山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）HRP標(biāo)記二抗（如A120-101P）。

免疫沉淀后WB：建議使用抗兔IgG輕鏈HRP標(biāo)記二抗，并在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020），避免檢測(cè)到IP抗體的重鏈（55 kDa）和輕鏈（25 kDa）。

陽(yáng)性對(duì)照：使用經(jīng)10 Gy電離輻射處理后回收1小時(shí)的人HeLa細(xì)胞裂解液。未處理細(xì)胞作為陰性對(duì)照（基礎(chǔ)磷酸化水平極低）。

6.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation， IP）

推薦用量：每毫克細(xì)胞裂解液總蛋白使用6 µg抗體。由于濃度200 µg/mL，6 µg抗體體積為30 µL。

操作建議：同標(biāo)準(zhǔn)IP流程。注意裂解液需含磷酸酶抑制劑，以維持磷酸化狀態(tài)。建議設(shè)置非特異性兔IgG作為陰性對(duì)照。

6.3 免疫組化（Immunohistochemistry， IHC）

推薦稀釋比：1:100 – 1:500

樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片

抗原修復(fù)：推薦使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），高壓或微波加熱修復(fù)。磷酸化表位對(duì)修復(fù)條件敏感，建議優(yōu)化時(shí)間（微波高火15分鐘）。

檢測(cè)：可使用HRP/DAB或熒光二抗。建議設(shè)置未處理對(duì)照組織及已知DNA損傷處理組織（如腫瘤組織或輻照組織）作為陽(yáng)性對(duì)照。

6.4 免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）與免疫細(xì)胞化學(xué)/免疫熒光（ICC-IF）

推薦稀釋比：1:200 – 1:1000

固定與透化：推薦4%多聚甲醛固定15–20分鐘，隨后0.2–0.5% Triton X-100透化10分鐘。不推薦丙酮固定，可能破壞表位。

預(yù)期定位：DNA損傷后，KAP-1 pSer824在細(xì)胞核中呈現(xiàn)點(diǎn)狀或彌散分布，與DNA損傷位點(diǎn)共定位。

對(duì)照：未處理細(xì)胞信號(hào)應(yīng)極弱；輻照或藥物處理的細(xì)胞顯示強(qiáng)核信號(hào)。

七、參考文獻(xiàn)（部分）：

Ziv Y， et al. (2006) *Nat Cell Biol* 8: 870–876.

Goodarzi AA， et al. (2008) *J Cell Biol* 182: 283–295.

White D， et al. (2017) *DNA Repair* 56: 114–121.

注意：本產(chǎn)品僅限研究使用，不得用于診斷或治療。用戶應(yīng)自行驗(yàn)證抗體在其特定實(shí)驗(yàn)體系中的適用性。以上信息覆蓋了本抗體的全部規(guī)格、制備細(xì)節(jié)、多平臺(tái)應(yīng)用參數(shù)及背景知識(shí)，使用者可據(jù)此快速建立KAP-1 Ser824磷酸化檢測(cè)方案，獲得特異、靈敏且可重復(fù)的結(jié)果