一、產(chǎn)品概述

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗RbBP5（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白5）多克隆抗體（貨號(hào)：A300-109A），經(jīng)抗原親和純化，特異性識(shí)別人類和小鼠RbBP5蛋白?？贵w適用于染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、ChIP-chip、ChIP-Seq、免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）、免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB）等多種研究場(chǎng)景?？贵w以未偶聯(lián)（Unconjugated）的全I(xiàn)gG形式提供，濃度高達(dá)1000 µg/ml，保存于2–8°C條件下，有效期自收貨之日起為1年。產(chǎn)品原產(chǎn)于美國(guó)，適用于表觀遺傳調(diào)控、組蛋白甲基化復(fù)合物及腫瘤抑制相關(guān)研究。

二、核心技術(shù)規(guī)格

參數(shù)項(xiàng) | 具體規(guī)格

靶標(biāo) | RbBP5（視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤結(jié)合蛋白5）

反應(yīng)種屬 | 小鼠、人

適用實(shí)驗(yàn) | ChIP、ChIP-chip、ChIP-Seq、ICC、IHC、IP、WB

宿主 | 兔

克隆性 | 多克隆

抗體形式 | 全I(xiàn)gG

免疫原 | 人RbBP5蛋白488位至C末端（538位）區(qū)域

同種型 | IgG

偶聯(lián)物 | 未偶聯(lián)

純度 | 抗原親和純化

抗原種屬來(lái)源 | 人

濃度 | 1000 µg/ml

儲(chǔ)存溫度 | 2 – 8 °C

有效期 | 1年

緩沖液 | Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊d化鈉

表位信息：抗體識(shí)別的表位定位于人RbBP5蛋白第500位至C末端（第538位）之間的區(qū)域（參考序列NP_005048.2，GeneID 5929）。該C末端區(qū)域包含WD40重復(fù)結(jié)構(gòu)域的一部分，遠(yuǎn)離與WDR5、ASH2L等核心復(fù)合物亞基的結(jié)合界面，確保免疫沉淀后仍可檢測(cè)到完整的Set1樣復(fù)合物。

三、產(chǎn)品制備與質(zhì)量控制

3.1 純化工藝

抗體采用抗原親和純化：將對(duì)應(yīng)人RbBP5蛋白C末端區(qū)域（500–538位）的合成多肽或重組蛋白片段共價(jià)固定于固相支持物上，使兔免疫血清過(guò)柱，特異性IgG被吸附；經(jīng)充分洗滌去除未結(jié)合蛋白后，以低pH緩沖液洗脫目標(biāo)抗體，隨后中和、透析并置換至含防腐劑的緩沖液中。

3.2 濃度測(cè)定

免疫球蛋白濃度通過(guò)比爾-朗伯定律確定：1 mg/ml純化IgG在280 nm波長(zhǎng)處的吸光度（A280）為1.4。本產(chǎn)品批次實(shí)測(cè)A280值經(jīng)換算確保濃度為1000 µg/ml，批間一致性高。

3.3 純度與特異性驗(yàn)證

抗原親和純化工藝可有效去除兔血清中的非特異性IgG及其他血清蛋白。經(jīng)SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色評(píng)估，抗體純度典型值≥95%。功能性特異性通過(guò)以下方式驗(yàn)證：

在RbBP5敲除細(xì)胞裂解物中WB檢測(cè)無(wú)信號(hào)

過(guò)表達(dá)RbBP5的細(xì)胞中信號(hào)顯著增強(qiáng)

免疫沉淀后質(zhì)譜鑒定確認(rèn)僅富集RbBP5及其已知相互作用伙伴（如MLL家族、WDR5、ASH2L等）

四、推薦應(yīng)用與稀釋方案

以下用量和稀釋范圍為推薦起始值。由于不同實(shí)驗(yàn)體系存在差異，用戶需根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行優(yōu)化。

4.1 免疫印跡（Western Blot，WB）

推薦稀釋范圍：1:10,000 – 1:25,000

封閉與抗體稀釋液：含5%脫脂奶粉的TBST（Tris緩沖鹽+0.1% Tween-20）

一抗孵育條件：4°C 過(guò)夜（推薦）

推薦二抗：山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）抗體，貨號(hào)A120-101P

特殊注意事項(xiàng)：當(dāng)對(duì)免疫沉淀產(chǎn)物進(jìn)行WB檢測(cè)時(shí)，建議使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體（輕鏈特異性），并在封閉緩沖液中加入5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020），以避免重鏈交叉反應(yīng)干擾。

陽(yáng)性對(duì)照：HeLa、HEK293T或小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF）全細(xì)胞裂解液。RbBP5在多種細(xì)胞系中普遍表達(dá)。

4.2 免疫沉淀（Immunoprecipitation，IP）

推薦用量：6 µg 抗體 / mg 細(xì)胞裂解液總蛋白

裂解液選擇：推薦使用溫和非變性裂解液（如含150 mM NaCl、0.5% NP-40、50 mM Tris-HCl pH 7.4、蛋白酶抑制劑混合物）。為保留完整Set1樣復(fù)合物，避免使用高濃度SDS或強(qiáng)變性劑。

孵育條件：裂解液與抗體4°C旋轉(zhuǎn)孵育2–4小時(shí)或過(guò)夜，隨后加入Protein A瓊脂糖珠繼續(xù)孵育1–2小時(shí)。

洗脫：可采用SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5分鐘洗脫，或使用低pH甘氨酸緩沖液進(jìn)行非變性洗脫。

陰性對(duì)照：使用同種型兔IgG（非免疫IgG）進(jìn)行平行沉淀，以評(píng)估非特異性背景。

4.3 染色質(zhì)免疫沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）

本抗體已有成功用于ChIP、ChIP-chip和ChIP-Seq的記錄（參考文獻(xiàn)：Dou et al., Nat Struct Mol Biol 13(8):713-719, 2006）。

ChIP類型 | 推薦用量 | 備注

ChIP（qPCR檢測(cè)） | 1 – 3 µg / 反應(yīng) | 每個(gè)IP反應(yīng)使用1–3 µg抗體

ChIP-chip | 10 µg / 反應(yīng) | 用于芯片雜交，需要較高抗體量

ChIP-Seq | 2 µg / 反應(yīng) | 用于高通量測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建

4.4 免疫組織化學(xué)（Immunohistochemistry，IHC）

推薦稀釋范圍：1:500 – 1:2,000

抗原修復(fù)：推薦使用檸檬酸鹽緩沖液（10 mM，pH 6.0）進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)（微波或高壓）

樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片

檢測(cè)系統(tǒng)：推薦使用聚合物標(biāo)記的HRP二抗系統(tǒng)

陽(yáng)性對(duì)照組織：小鼠或人睪丸組織（RbBP5在減數(shù)分裂細(xì)胞中高表達(dá)）、HeLa細(xì)胞蠟塊

IHC操作提示：RbBP5定位于細(xì)胞核，呈彌散或斑點(diǎn)狀分布。建議在封閉步驟中使用5%正常山羊血清阻斷非特異性結(jié)合。

4.5 免疫細(xì)胞化學(xué)（Immunocytochemistry，ICC）

推薦稀釋范圍：1:250 – 1:1,000

樣本類型：細(xì)胞爬片或培養(yǎng)細(xì)胞（4%多聚甲醛固定）

透化：0.5% Triton X-100處理10分鐘

封閉：5%正常血清（來(lái)自二抗宿主）

檢測(cè)：熒光標(biāo)記二抗或HRP顯色

儲(chǔ)存穩(wěn)定性

抗體于2–8°C運(yùn)輸和保存，請(qǐng)勿冷凍。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體聚集和活性下降。若需長(zhǎng)期保存，可分裝后置于-80°C，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

五、參考文獻(xiàn)與應(yīng)用支持

本抗體已成功應(yīng)用于以下研究（參考已發(fā)表文獻(xiàn)）：

Dou et al., Nat Struct Mol Biol 13(8):713-719, 2006（ChIP驗(yàn)證）

該研究證實(shí)RbBP5作為MLL復(fù)合物的核心成分，對(duì)H3K4甲基化和HOX基因表達(dá)至關(guān)重要。