一、產(chǎn)品概述

本產(chǎn)品由艾美捷Bethyl Laboratories推出，是一款針對人RPA32（RPA2）蛋白第33位絲氨酸（Ser33）磷酸化形式的特異性兔多克隆抗體（貨號：A300-246A），經(jīng)抗原親和純化制備。該抗體經(jīng)驗證適用于蛋白質(zhì)印跡（WB）檢測，可特異性地識別細(xì)胞周期S期及DNA損傷應(yīng)答中發(fā)生磷酸化的RPA32，僅供研究使用。

RPA（復(fù)制蛋白A）是一個異源三聚體復(fù)合物，由70 kDa（RPA1）、32 kDa（RPA2/RPA32）和14 kDa（RPA3）三個亞基組成。RPA在DNA復(fù)制、重組及修復(fù)中發(fā)揮核心作用，與MSH2、MLH1、PCNA及DNA聚合酶δ共同參與DNA錯配修復(fù)。RPA32亞基在細(xì)胞進(jìn)入S期時被cdc2家族激酶磷酸化，在DNA損傷時則被ATM、ATR及DNA-PK磷酸化。Ser33位點的磷酸化是RPA32激活的重要標(biāo)志，廣泛應(yīng)用于細(xì)胞周期及DNA損傷應(yīng)答研究。

二、產(chǎn)品規(guī)格

參數(shù) 詳細(xì)信息

靶標(biāo) RPA32 磷酸化 (Ser33)

反應(yīng)種屬 人

應(yīng)用 WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 完整IgG

免疫原 圍繞絲氨酸33位的磷酸化合成肽

同種型 IgG

偶聯(lián)物 未偶聯(lián)

純度 抗原親和純化

抗原種屬 人

濃度 1000 µg/mL（1 mg/mL）

緩沖液 Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含0.09%疊d化鈉

儲存條件 2–8°C

有效期 自收貨之日起1年

三、靶標(biāo)詳細(xì)信息

3.1別名

REPA2， replication factor A protein 2， replication protein A 32 kDa subunit， replication protein A 34 kDa subunit， RF-A protein 2， RP-A p32， RP-A p34， RPA32。

3.3 功能背景

RPA是最重要的單鏈DNA結(jié)合蛋白復(fù)合物，其32 kDa亞基（RPA32）的磷酸化是調(diào)控DNA代謝的關(guān)鍵事件：

細(xì)胞周期依賴性磷酸化：當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入S期時，cdc2家族激酶（如CDK2/cyclin E）磷酸化RPA32的Ser33和Ser29位點，促進(jìn)DNA復(fù)制叉的建立。

DNA損傷應(yīng)答磷酸化：在電離輻射、紫外線或化療藥物引起的DNA損傷時，ATM、ATR及DNA-PK激酶磷酸化RPA32的多個位點（包括Ser33），從而激活DNA修復(fù)通路并調(diào)控細(xì)胞周期檢查點。

功能意義：磷酸化的RPA32增強(qiáng)RPA復(fù)合物與單鏈DNA的結(jié)合能力，并招募下游修復(fù)因子。Ser33位點的磷酸化被廣泛用作DNA復(fù)制壓力和基因毒性應(yīng)激的生物標(biāo)志物。

四、抗體制備與純化

4.1 免疫原及表位定位

本抗體采用磷酸化合成肽作為免疫原。該肽段代表人RPA32蛋白中圍繞第33位絲氨酸的氨基酸序列，該絲氨酸以磷酸化形式存在（參考序列NP_002937.1）。通過使用磷酸化抗原，免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性識別磷酸化表位的抗體，而不識別非磷酸化形式的RPA32。

4.2 純化方法

抗體通過抗原親和層析純化。將磷酸化合成肽固定于固相載體，使抗血清中的特異性IgG結(jié)合于該磷酸化表位，經(jīng)洗脫獲得高純度抗體。此法確保最終產(chǎn)品中只保留識別RPA32 pSer33的抗體分子，顯著降低與非磷酸化RPA32或其他磷酸化蛋白的交叉反應(yīng)。

4.3 濃度測定

免疫球蛋白濃度采用比爾定律測定，以1 mg/mL IgG在280 nm下的吸光度（A280）為1.4作為標(biāo)準(zhǔn)。實測濃度為1000 µg/mL（1 mg/mL）。

4.4 緩沖液與防腐劑

抗體儲存于Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液（pH 7–8），含0.09%疊d化鈉作為防腐劑。注意：疊d化鈉有毒，操作時請佩戴防護(hù)手套。若用于需要疊氮化物敏感的細(xì)胞實驗或動物注射，使用前應(yīng)通過透析或超濾去除。

五、儲存與穩(wěn)定性

收到產(chǎn)品后，請將抗體置于2–8°C條件下儲存。切勿冷凍，反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性聚集、效價下降。在推薦的儲存條件下，自收貨之日起1年內(nèi)可保持穩(wěn)定。由于本品為磷酸化特異性抗體，尤其應(yīng)避免溫度波動和反復(fù)凍融，建議分裝后-20°C凍存（每份適量，避免多次解凍）。分裝時使用低吸附管，并確保分裝后立即冷凍。

六、常見問題（FAQ）

Q1：WB檢測出現(xiàn)多條非特異性條帶（如55 kDa、70 kDa），可能原因？  

A1：本抗體為磷酸化特異性多抗，高濃度下可能識別其他磷酸化蛋白。建議：①嚴(yán)格按照推薦稀釋比1:20,000以上使用；②延長封閉時間或更換封閉液（5% BSA-TBST）；③使用高靈敏度ECL并縮短曝光時間。

Q2：未處理細(xì)胞中也出現(xiàn)較強(qiáng)的32 kDa信號，為什么？  

A2：部分細(xì)胞系（如HeLa、U2OS）在常規(guī)培養(yǎng)條件下由于內(nèi)源性復(fù)制壓力，RPA32 Ser33呈現(xiàn)基礎(chǔ)水平的磷酸化。解決方法：①使用血清饑餓或接觸抑制使細(xì)胞退出周期；②使用同步化至G1期的細(xì)胞作為陰性對照；③設(shè)置λ磷酸酶處理樣本驗證特異性。

Q3：DNA損傷處理后信號沒有增強(qiáng)，可能原因？  

A3：檢查以下幾點：①損傷處理是否有效（建議設(shè)置平行樣本檢測γH2AX作為陽性對照）；②裂解液中是否添加了磷酸酶抑制劑；③抗體是否過期或反復(fù)凍融；④轉(zhuǎn)膜效率是否正常（麗春紅染色檢查）；⑤一抗孵育是否過短（需4°C過夜）。

Q4：抗體能否用于免疫沉淀（IP）或免疫熒光（IF）？  

A4：本產(chǎn)品僅驗證用于WB。用戶可自行嘗試IP，但由于磷酸化表位可能受IP條件影響，成功率不確定。不推薦用于IF，因為固定和透化過程中磷酸化信號可能丟失。

Q5：能否檢測小鼠或大鼠的RPA32 Ser33磷酸化？  

A5：本抗體僅經(jīng)驗證針對人源蛋白。小鼠RPA32 Ser33在序列上不保守（人Ser33對應(yīng)小鼠Ser31），不建議使用。如需鼠源檢測，請聯(lián)系技術(shù)支持。