產(chǎn)品概述

本品為艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗DDX5（DEAD-box解旋酶5）多克隆抗體（貨號：A300-523A），經(jīng)表位特異性親和純化，以未標(biāo)記形式提供。DDX5（亦稱p68、RNA解旋酶p68）是DEAD-box蛋白家族的成員，在RNA代謝的多個層面（包括前體mRNA剪接、RNA合成與降解、核糖體生物發(fā)生等）發(fā)揮核心作用，并參與轉(zhuǎn)錄共激活調(diào)控。本抗體識別人和小鼠DDX5蛋白，適用于免疫組織化學(xué)、免疫沉淀及免疫印跡檢測，是RNA代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、激素信號通路及癌癥研究的實(shí)用工具。

基本規(guī)格參數(shù)

參數(shù) 具體信息

靶標(biāo) DDX5（DEAD-box解旋酶5）

反應(yīng)種屬 小鼠、人

應(yīng)用 IHC, IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全I(xiàn)gG

免疫原 位于第564位至C端之間的區(qū)域

自身抗體亞型 IgG

標(biāo)記物 未標(biāo)記

純度 抗原親和純化

抗原種屬 人

濃度 200 µg/ml

保存溫度 2 - 8 °C

有效期 自收貨之日起1年

緩沖液 Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA和0.09%疊氮鈉

生產(chǎn)與純化工藝

本抗體的生產(chǎn)采用表位特異性親和純化策略：

1. 免疫原設(shè)計(jì)：針對人DDX5蛋白中第575位至C端（第614位）之間的區(qū)域（參考序列NP_004387.1）。該C端區(qū)域在DDX5和其同源蛋白DDX17之間存在差異，有利于特異性識別。

2. 免疫程序：使用上述合成肽段對兔進(jìn)行免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗血清。

3. 親和純化：將DDX5特異的C端表位肽固定于固相支持介質(zhì)上，通過親和層析從抗血清中特異性分離目標(biāo)抗體。該策略確?？贵w僅識別目標(biāo)表位，減少非特異性背景。

4. 濃度測定：依據(jù)比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm波長下的吸光度（A280）為1.4。本品最終濃度為200 µg/ml。

表位定位：抗體識別的表位位于人DDX5蛋白的第575-614殘基之間（C端區(qū)域）。該區(qū)域在小鼠DDX5中高度保守，因此抗體可與小鼠源DDX5發(fā)生交叉反應(yīng)。

特異性驗(yàn)證

反應(yīng)種屬：人、小鼠

識別表位：DDX5蛋白C端區(qū)域（575-614 aa）

經(jīng)免疫印跡和免疫沉淀驗(yàn)證的特異性：與人及小鼠DDX5特異性結(jié)合

與DDX17的關(guān)系：DDX5與DDX17高度同源并形成異源二聚體。本抗體表位位于C端，該區(qū)域兩者相似度較低，因此抗體可能不識別DDX17或識別效率較低，但用戶仍需通過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

潛在交叉反應(yīng)：DEAD-box家族成員眾多（如DDX3、DDX17等），保守結(jié)構(gòu)域廣泛存在。由于本抗體采用C端特異表位，理論上可降低與其他家族成員的交叉反應(yīng)。

生物學(xué)背景

DDX5（基因符號：DDX5，GeneID: 1655，UniProt: P17844）是DEAD-box家族RNA解旋酶的典型代表：

結(jié)構(gòu)特征：DDX5包含DEAD-box蛋白的多個保守基序，其中最著名的是Asp-Glu-Ala-Asp（DEAD）氨基酸序列。該基序賦予ATP依賴的RNA解旋酶活性。

核心功能：

RNA代謝全能參與者：DDX5參與前體mRNA剪接、RNA合成、降解、核輸出、翻譯起始、RNA二級結(jié)構(gòu)形成、核糖體生物發(fā)生以及核糖核蛋白復(fù)合物的組裝。

轉(zhuǎn)錄共激活：除RNA解旋酶功能外，DDX5還可作為轉(zhuǎn)錄共激活因子與多種轉(zhuǎn)錄因子/共調(diào)節(jié)因子相互作用，包括：雌激素受體α（ERα，共激活）、CBP/p300、Smad3、p53。通過這些互作，DDX5調(diào)控雌激素信號、TGF-β應(yīng)答和DNA損傷應(yīng)答等相關(guān)基因的表達(dá)。

與DDX17協(xié)同：DDX5與DDX17形成異源二聚體，兩者在多種細(xì)胞過程中功能互補(bǔ)。

臨床意義：DDX5在多種癌癥（乳腺癌、結(jié)直腸癌、肝癌、膠質(zhì)瘤等）中異常表達(dá)，影響細(xì)胞增殖、侵襲和化療敏感性，是潛在的治療靶點(diǎn)和預(yù)后標(biāo)志物。

應(yīng)用與推薦稀釋比例

以下推薦稀釋比例為起始參考值。需注意，并非所有列出的應(yīng)用均已在本實(shí)驗(yàn)室完成具體驗(yàn)證，建議用戶根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行梯度優(yōu)化。

應(yīng)用 推薦稀釋比例或用量 備注

免疫組織化學(xué) 1:200 - 1:1000 FFPE組織切片推薦使用檸檬酸緩沖液pH6.0進(jìn)行抗原修復(fù)

免疫沉淀 6 µg/mg 裂解物 即每毫克總蛋白使用6微克抗體

免疫印跡 1:2000 - 1:10,000 詳見下方標(biāo)準(zhǔn)操作條件

免疫印跡標(biāo)準(zhǔn)操作條件（經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證）：

封閉液和抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶-TBST

一抗孵育：過夜（4°C或室溫）

細(xì)胞裂解液WB的二抗：使用山羊抗兔IgG（H+L）抗體（貨號A120-101P）

免疫沉淀樣本W(wǎng)B的二抗：使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，并在封閉緩沖液中添加5%正常豬血清（貨號S100-020），以避免重鏈交叉信號干擾

免疫組織化學(xué)（IHC）典型流程（FFPE組織切片）：

1. 脫蠟和水化

2. 抗原修復(fù)：使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），高壓或微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)

3. 封閉內(nèi)源性過氧化物酶（如適用）

4. 一抗孵育：1:200-1:1000，4°C過夜

5. 二抗及顯色

DDX5主要定位于細(xì)胞核（核漿和核仁），在IHC中應(yīng)呈現(xiàn)核染色模式。

免疫沉淀（IP）指南：

每毫克細(xì)胞裂解物總蛋白使用6 µg抗體（本品濃度為200 µg/ml，即每毫克裂解物需使用30 µl抗體）

建議使用蛋白A/G瓊脂糖珠（兔源抗體推薦蛋白A）

裂解緩沖液推薦使用非變性裂解液（如含1% NP-40的RIPA緩沖液，不含SDS或SDS<0.1%）

設(shè)正常兔IgG作為同型對照

陽性對照建議：

人源細(xì)胞系（如HeLa、HEK293T、MCF-7）或小鼠細(xì)胞系（如NIH/3T3）的全細(xì)胞裂解物

DDX5在大多數(shù)細(xì)胞系中廣泛表達(dá)，可選用

陰性對照建議：

使用正常兔IgG替代一抗

使用DDX5敲低（siRNA）或敲除細(xì)胞裂解物（如CRISPR DDX5敲除細(xì)胞系）

使用與保存注意事項(xiàng)

保存條件：請于2-8°C條件下保存，切勿冷凍。反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性失效。在指定條件下，自收貨之日起1年內(nèi)穩(wěn)定有效。

緩沖液成分：本抗體溶于Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA（穩(wěn)定劑）和0.09%疊氮鈉（防腐劑）。BSA的存在有助于防止抗體在低濃度下吸附于管壁，但如需進(jìn)行無蛋白的標(biāo)記反應(yīng)（如生物素標(biāo)記），建議先通過透析去除BSA和疊氮鈉。

稀釋緩沖液建議：

WB：使用5%牛奶-TBST

IHC：使用含1% BSA或正常血清的PBS

IP：使用裂解緩沖液本身稀釋抗體

分子量信息：人DDX5蛋白的理論分子量約為69 kDa（UniProt P17844）。在還原性SDS-PAGE中，可觀察到約68-70 kDa的條帶（有時稱為p68）。若在預(yù)測分子量以外位置觀察到額外條帶，可能為降解產(chǎn)物或翻譯后修飾。