產(chǎn)品概述

本品為艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗PHD2（脯氨酰羥化酶結(jié)構(gòu)域蛋白2）多克隆抗體（貨號：A300-322A），經(jīng)表位特異性親和純化，以未標(biāo)記形式提供。PHD2是氧感知通路中的關(guān)鍵酶，通過催化HIF-1α的脯氨酰羥化修飾，調(diào)控細(xì)胞對低氧環(huán)境的適應(yīng)性反應(yīng)。本抗體特異性識別人PHD2蛋白，適用于免疫沉淀和免疫印跡檢測，是缺氧信號通路、腫瘤微環(huán)境及代謝適應(yīng)研究的實(shí)用工具。

基本規(guī)格參數(shù)

參數(shù) 具體信息

靶標(biāo) PHD2（EGLN1/HIF-PH2）

反應(yīng)種屬 人

應(yīng)用 IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全I(xiàn)gG

免疫原 位于第1-50氨基酸殘基之間的區(qū)域

自身抗體亞型 IgG

標(biāo)記物 未標(biāo)記

純度 抗原親和純化

抗原種屬 人

濃度 1000 µg/ml （1 mg/ml）

保存溫度 2 8 °C

有效期 自收貨之日起1年

緩沖液 Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮鈉

生產(chǎn)與純化工藝

本抗體的生產(chǎn)采用表位特異性親和純化策略：

1. 免疫原設(shè)計(jì)：針對人PHD2蛋白中第1至50位氨基酸之間的N端區(qū)域（參考序列NP_071334.1）。該區(qū)域遠(yuǎn)離C端的催化結(jié)構(gòu)域，有利于特異性識別PHD2而不與其他PHD家族成員發(fā)生交叉反應(yīng)。

2. 免疫程序：使用上述合成肽段對兔進(jìn)行免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗血清。

3. 親和純化：將PHD2特異的N端表位肽固定于固相支持介質(zhì)上，通過親和層析從抗血清中特異性分離目標(biāo)抗體。該策略確?？贵w僅識別目標(biāo)表位，減少非特異性背景。

4. 濃度測定：依據(jù)比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm波長下的吸光度（A280）為1.4。本品最終濃度為1 mg/ml（1000 µg/ml）。

表位定位：抗體識別的表位位于人PHD2蛋白的N端前50個(gè)氨基酸（NP_071334.1編號）。由于該區(qū)域在不同PHD家族成員中特異性較高，本抗體不易與PHD1、PHD3交叉反應(yīng)，但該信息未在規(guī)格中明確驗(yàn)證，建議用戶根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要自行確認(rèn)。

特異性驗(yàn)證

反應(yīng)種屬：人（已驗(yàn)證）。對小鼠、大鼠等種屬的交叉反應(yīng)性未明確提供，建議使用前通過免疫印跡預(yù)驗(yàn)證。

識別表位：PHD2蛋白N端區(qū)域（1-50 aa）

經(jīng)免疫印跡和免疫沉淀驗(yàn)證的特異性：與人PHD2特異性結(jié)合

潛在交叉反應(yīng)：PHD2屬于EGLN家族，與PHD1/EGLN2和PHD3/EGLN3具有較高的序列同源性（尤其在催化結(jié)構(gòu)域）。本抗體采用N端表位設(shè)計(jì)，理論上可降低與PHD1/3的交叉反應(yīng)，但用戶在使用時(shí)仍建議設(shè)置已知表達(dá)PHD2、PHD1和PHD3的細(xì)胞裂解物作為平行對照。

生物學(xué)背景

PHD2（基因符號：EGLN1，GeneID: 54583，UniProt: Q9GZT9）是氧感知通路的核心組分：

結(jié)構(gòu)特征：PHD2屬于2-氧戊二酸依賴性雙加氧酶家族，包含一個(gè)C端的脯氨酰羥化酶催化結(jié)構(gòu)域和N端的MYND型鋅指結(jié)構(gòu)域。

核心功能：

氧傳感器：PHD2是4種PHD酶（PHD1-4）中對氧濃度最敏感的亞型，在常氧條件下（normoxia）催化HIF-1α蛋白第402和564位脯氨酸殘基的羥基化。

HIF-1α降解調(diào)控：羥基化修飾后的HIF-1α被VHL（von Hippel-Lindau）泛素連接酶復(fù)合物識別，經(jīng)泛素-蛋白酶體途徑降解。低氧條件下，PHD2活性受抑，HIF-1α得以穩(wěn)定并轉(zhuǎn)位至核內(nèi)，激活下游靶基因（如VEGF、EPO、GLUT1）的轉(zhuǎn)錄。

非冗余功能：PHD1、PHD2和PHD3在組織表達(dá)譜和底物選擇性上存在差異。PHD2被認(rèn)為是調(diào)控HIF-1α穩(wěn)定性的主要亞型，而PHD1和PHD3可能在其他底物或特定組織發(fā)揮補(bǔ)充作用。

臨床意義：EGLN1基因突變與紅細(xì)胞增多癥（ECYT3）相關(guān)；PHD2也是多種實(shí)體瘤（腎癌、乳腺癌、膠質(zhì)瘤）中HIF通路異常激活的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，是抗腫瘤藥物研發(fā)的靶點(diǎn)。

應(yīng)用與推薦稀釋比例

以下推薦稀釋比例為起始參考值。需注意，并非所有列出的應(yīng)用均已在本實(shí)驗(yàn)室完成具體驗(yàn)證，建議用戶根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行梯度優(yōu)化。

應(yīng)用 推薦用量或稀釋比例 備注

免疫沉淀 6 µg/mg 裂解物 即每毫克總蛋白使用6微克抗體

免疫印跡 1:500 1:2,500 詳見下方標(biāo)準(zhǔn)操作條件

免疫印跡標(biāo)準(zhǔn)操作條件（經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證）：

封閉液和抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶-TBST

一抗孵育：過夜（4°C或室溫）

細(xì)胞裂解液WB的二抗：使用山羊抗兔IgG（H+L）抗體（貨號A120-101P）

免疫沉淀樣本W(wǎng)B的二抗：使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，并在封閉緩沖液中添加5%正常豬血清（貨號S100-020），以避免重鏈交叉信號干擾

免疫沉淀（IP）指南：

每毫克細(xì)胞裂解物總蛋白使用6 µg抗體

建議使用蛋白A/G瓊脂糖珠（兔源抗體推薦蛋白A）

裂解緩沖液推薦使用非變性裂解液（如1% NP-40或Triton X-100，不含SDS）以保留蛋白復(fù)合物

設(shè)正常兔IgG作為同型對照

陽性對照建議：

人源細(xì)胞系（如HeLa、HEK293T、HepG2、U2OS）的全細(xì)胞裂解物

常氧條件下PHD2表達(dá)量相對穩(wěn)定，但注意PHD2蛋白半衰期較短，建議使用新鮮制備的裂解物

低氧處理樣本可作為功能驗(yàn)證對照（HIF-1α穩(wěn)定化，PHD2表達(dá)可能代償性上調(diào)）

陰性對照建議：

使用正常兔IgG替代一抗

使用PHD2敲低（siRNA/shRNA）或CRISPR敲除細(xì)胞裂解物

使用與保存注意事項(xiàng)

保存條件：請于2-8°C條件下保存，切勿冷凍。反復(fù)凍融會導(dǎo)致抗體變性失效。在指定條件下，自收貨之日起1年內(nèi)穩(wěn)定有效。

緩沖液成分：本抗體溶于Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液（pH 7-8），含0.09%疊氮鈉作為防腐劑。如后續(xù)實(shí)驗(yàn)涉及對疊氮鈉敏感的酶學(xué)檢測或細(xì)胞培養(yǎng)，請通過透析或脫鹽柱去除。

稀釋緩沖液建議：

WB：使用5%牛奶-TBST

IP：使用裂解緩沖液本身稀釋抗體。建議IP實(shí)驗(yàn)中抗體與裂解物體積比不低于1:100，以保證有效結(jié)合。

分子量信息：人PHD2蛋白的理論分子量約為46 kDa（UniProt Q9GZT9）。在還原性SDS-PAGE中，可觀察到約42-48 kDa的條帶。若在預(yù)測分子量以外位置觀察到額外條帶，可能為降解產(chǎn)物、翻譯后修飾或非特異性條帶。