產(chǎn)品概述

本品為艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源抗KAP-1（KRAB相關(guān)蛋白1）多克隆抗體（貨號：A300-275A），經(jīng)表位特異性親和純化，以未標(biāo)記形式提供。KAP-1（亦稱TRIM28、TIF1β）是三基序蛋白家族的成員，作為轉(zhuǎn)錄共抑制因子和染色質(zhì)重塑復(fù)合物的支架蛋白，在基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮核心作用。本抗體識別人和小鼠KAP-1蛋白，適用于免疫組織化學(xué)、免疫沉淀及免疫印跡檢測，是表觀遺傳學(xué)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控及癌癥研究的實(shí)用工具。

基本規(guī)格參數(shù)

參數(shù) 具體信息

靶標(biāo) KAP-1（TRIM28/TIF1β）

反應(yīng)種屬 小鼠、人

應(yīng)用 IHC, IP, WB

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 全I(xiàn)gG

免疫原 位于第650-700氨基酸殘基之間的區(qū)域

自身抗體亞型 IgG

標(biāo)記物 未標(biāo)記

純度 抗原親和純化

抗原種屬 人

濃度 1000 µg/ml （1 mg/ml）

保存溫度 2 - 8 °C

有效期 自收貨之日起1年

緩沖液 Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮鈉

生產(chǎn)與純化工藝

本抗體的生產(chǎn)采用表位特異性親和純化策略：

1. 免疫原設(shè)計(jì)：針對人KAP-1蛋白中第650至700位氨基酸之間的區(qū)域（參考序列NP_005753.1）。該區(qū)域位于蛋白質(zhì)的PHD finger和Bromo domain之間的連接區(qū)，特異性較高。

2. 免疫程序：使用上述合成肽段對兔進(jìn)行免疫，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗血清。

3. 親和純化：將KAP-1特異的表位肽固定于固相支持介質(zhì)上，通過親和層析從抗血清中特異性分離目標(biāo)抗體。該策略確保抗體僅識別目標(biāo)表位，減少非特異性背景。

4. 濃度測定：依據(jù)比爾定律，1 mg/ml IgG在280 nm波長下的吸光度（A280）為1.4。本品最終濃度為1 mg/ml（1000 µg/ml）。

表位定位：抗體識別的表位位于人KAP-1蛋白的第650-700殘基之間（NP_005753.1編號）。該區(qū)域在小鼠KAP-1中高度保守，因此抗體可與小鼠源KAP-1發(fā)生交叉反應(yīng)。

特異性驗(yàn)證

反應(yīng)種屬：人、小鼠

識別表位：KAP-1蛋白內(nèi)部區(qū)域（650-700 aa）

經(jīng)ELISA和免疫印跡驗(yàn)證的特異性：與人及小鼠KAP-1特異性結(jié)合

潛在交叉反應(yīng)：KAP-1屬于TRIM家族（含RING指、B box和卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域），與家族其他成員可能有一定同源性。本抗體是否識別TRIM28以外的蛋白未明確驗(yàn)證，建議在實(shí)驗(yàn)中設(shè)置敲低或敲除對照以確認(rèn)條帶特異性。

生物學(xué)背景

KAP-1（基因符號：TRIM28，GeneID: 10155，UniProt: Q13263）是轉(zhuǎn)錄調(diào)控和染色質(zhì)重塑的關(guān)鍵因子：

結(jié)構(gòu)特征：KAP-1包含RING指結(jié)構(gòu)域、B box結(jié)構(gòu)域和α螺旋卷曲螺旋區(qū)（RBCC/TRIM基序）。這些結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)蛋白-蛋白相互作用和酶活性（E3 SUMO連接酶和E3泛素連接酶）。

核心功能：

轉(zhuǎn)錄共抑制：KAP-1通過結(jié)合KRAB鋅指轉(zhuǎn)錄抑制因子的KRAB結(jié)構(gòu)域發(fā)揮作用，招募包含SETDB1組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶和NuRD復(fù)合物等染色質(zhì)修飾酶，介導(dǎo)H3K9me3和異染色質(zhì)形成。

染色質(zhì)重塑支架：作為多蛋白復(fù)合物的支架，KAP-1參與異染色質(zhì)的建立和維持，在胚胎發(fā)育、基因組印記和內(nèi)源逆轉(zhuǎn)錄病毒沉默中起關(guān)鍵作用。

翻譯后修飾調(diào)控：KAP-1可被ATM/ATR磷酸化，響應(yīng)DNA損傷信號；也可被SUMO化修飾，調(diào)節(jié)其抑制活性。

臨床意義：KAP-1在多種癌癥中過表達(dá)（如乳腺癌、肝癌、膠質(zhì)瘤），與腫瘤進(jìn)展和耐藥性相關(guān)；同時(shí)也是KRAB-ZFP介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)。

應(yīng)用與推薦稀釋比例

以下推薦稀釋比例為起始參考值。需注意，并非所有列出的應(yīng)用均已在本實(shí)驗(yàn)室完成具體驗(yàn)證，建議用戶根據(jù)樣本類型和實(shí)驗(yàn)體系進(jìn)行梯度優(yōu)化。

應(yīng)用 推薦稀釋比例或用量 備注

免疫組織化學(xué) 1:1000 - 1:5000 FFPE組織切片推薦使用檸檬酸緩沖液pH6.0進(jìn)行抗原修復(fù)

免疫沉淀 6 µg/mg 裂解物 即每毫克總蛋白使用6微克抗體

免疫印跡 1:2000 - 1:10,000 詳見下方標(biāo)準(zhǔn)操作條件

免疫印跡標(biāo)準(zhǔn)操作條件（經(jīng)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證）：

封閉液和抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶-TBST

一抗孵育：過夜（4°C或室溫）

細(xì)胞裂解液WB的二抗：使用山羊抗兔IgG（H+L）抗體（貨號A120-101P）

免疫沉淀樣本W(wǎng)B的二抗：使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，并在封閉緩沖液中添加5%正常豬血清（貨號S100-020），以避免重鏈交叉信號干擾

免疫組織化學(xué)（IHC）典型流程（FFPE組織切片）：

1. 脫蠟和水化

2. 抗原修復(fù)：使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），高壓或微波加熱進(jìn)行抗原修復(fù)

3. 封閉內(nèi)源性過氧化物酶（如適用）

4. 一抗孵育：1:1000-1:5000，4°C過夜

5. 二抗及顯色

KAP-1主要定位于細(xì)胞核，在IHC中應(yīng)呈現(xiàn)核染色模式。

免疫沉淀（IP）指南：

每毫克細(xì)胞裂解物總蛋白使用6 µg抗體

建議使用蛋白A/G瓊脂糖珠（兔源抗體推薦蛋白A）

裂解緩沖液推薦使用含蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液或非變性裂解液

設(shè)正常兔IgG作為同型對照

陽性對照建議：

人源細(xì)胞系（如HeLa、HEK293T）或小鼠細(xì)胞系（如NIH/3T3）的全細(xì)胞裂解物

KAP-1表達(dá)量較高的組織（如睪丸、胚胎組織）

陰性對照建議：

使用正常兔IgG替代一抗

使用KAP-1敲低或敲除細(xì)胞裂解物（如siRNA TRIM28處理樣本）

使用與保存注意事項(xiàng)

保存條件：請于2-8°C條件下保存，切勿冷凍。反復(fù)凍融會(huì)導(dǎo)致抗體變性失效。在指定條件下，自收貨之日起1年內(nèi)穩(wěn)定有效。

緩沖液成分：本抗體溶于Tris-檸檬酸鹽/磷酸鹽緩沖液（pH 7-8），含0.09%疊氮鈉作為防腐劑。如后續(xù)實(shí)驗(yàn)涉及對疊氮鈉敏感的酶學(xué)檢測或細(xì)胞培養(yǎng)，請通過透析或脫鹽柱去除。

稀釋緩沖液建議：

WB：使用5%牛奶-TBST

IHC：使用含1% BSA或正常血清的PBS

IP：使用裂解緩沖液本身稀釋抗體

分子量信息：人KAP-1蛋白的理論分子量約為89 kDa（UniProt Q13263）。在還原性SDS-PAGE中，可觀察到約90-100 kDa的條帶（翻譯后修飾可能導(dǎo)致分子量偏移）。若在預(yù)測分子量以外位置觀察到額外條帶，可能為降解產(chǎn)物、SUMO化或磷酸化修飾形式。