產(chǎn)品概述

本品為艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源多克隆抗體（貨號(hào)：A302-869A），特異性靶向人源RNF2蛋白（Ring Finger Protein 2，又稱RING1B、BAP-1）。該抗體經(jīng)抗原親和純化，以完整IgG形式提供，適用于染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-Seq）、免疫組織化學(xué)（IHC）、免疫沉淀（IP）和蛋白質(zhì)印跡（WB）實(shí)驗(yàn)，可識(shí)別人源RNF2蛋白。本品濃度為1000 µg/ml，為表觀遺傳學(xué)和泛素化研究提供了高靈敏度的檢測(cè)工具。

靶點(diǎn)背景：RNF2的多聚梳家族功能與E3泛素連接酶活性

RNF2（Ring finger protein 2）是多聚梳家族（Polycomb group, PcG）的核心蛋白成員，在轉(zhuǎn)錄抑制、染色質(zhì)修飾和早期發(fā)育中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

結(jié)構(gòu)與功能特征：

含有一個(gè)特征性的RING finger結(jié)構(gòu)域，賦予E3泛素連接酶活性

作為PRC1復(fù)合物（Polycomb repressive complex 1）的核心組分，催化組蛋白H2A第119位賴氨酸（H2AK119ub）的單泛素化修飾

通過與泛素結(jié)合酶HIP2（huntingtin interacting protein 2）相互作用，介導(dǎo)底物蛋白的泛素化降解

生物學(xué)功能：

與轉(zhuǎn)錄因子CP2（TFCP2/CP2）相互作用并抑制其活性

參與小鼠前后軸的特化以及早期發(fā)育中的細(xì)胞增殖調(diào)控

維持基因沉默狀態(tài)，在干細(xì)胞分化、X染色體失活和癌癥發(fā)生中發(fā)揮作用

別名： BAP-1、DING、HIPI3、RING1B、RING2、huntingtin-interacting protein 2-interacting protein 3、protein DinG等

抗體特性規(guī)格

參數(shù) 規(guī)格

靶點(diǎn) RNF2 (RING1B)

宿主 兔

克隆性 多克隆

形式 完整IgG

同種型 IgG

偶聯(lián)物 非偶聯(lián)

純度 抗原親和純化

濃度 1000 µg/ml（1 mg/ml）

抗原物種 人

反應(yīng)性 人（經(jīng)驗(yàn)證）

儲(chǔ)存與穩(wěn)定性

儲(chǔ)存溫度：2-8°C（請(qǐng)勿冷凍）

有效期：自收貨之日起1年

緩沖液：Tris-檸檬酸-磷酸緩沖液，pH 7-8，含0.09%疊氮鈉

> 注意：本品濃度高達(dá)1000 µg/ml，使用前可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要稀釋至工作濃度。疊氮鈉作為防腐劑，進(jìn)行ChIP-Seq或HRP檢測(cè)時(shí)需注意去除。

應(yīng)用方法與實(shí)驗(yàn)條件

蛋白質(zhì)印跡（WB）

推薦稀釋度：1:2000 - 1:10,000

通用流程要點(diǎn)：

封閉液及抗體稀釋液：5% Milk-TBST

一抗孵育：過夜（4°C）

二抗選擇：

細(xì)胞裂解液WB：使用山羊抗兔IgG重鏈和輕鏈抗體（A120-101P）

免疫沉淀物WB：使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體，封閉液中添加5%正常豬血清（貨號(hào)S100-020），以避免IgG重鏈信號(hào)干擾（約55 kDa）

預(yù)期條帶：RNF2分子量約為38-42 kDa（實(shí)際遷移可能因修飾略有差異）。

免疫沉淀（IP）

使用劑量：6 µg抗體/mg細(xì)胞裂解液

免疫組織化學(xué)（IHC）

推薦稀釋度：1:500 - 1:2000

抗原修復(fù)：對(duì)于福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）組織切片，推薦使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0）進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)。

染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序（ChIP-Seq）

使用劑量：10 µg抗體/實(shí)驗(yàn)（參考Ram O et al., Cell. 2011 Dec 23;147(7):1628-39）

操作建議：

按照已發(fā)表的ChIP-Seq流程進(jìn)行染色質(zhì)片段化（超聲或酶切）

使用10 µg抗體與染色質(zhì)孵育過夜

推薦設(shè)置陰性對(duì)照（正常兔IgG）和陽性對(duì)照（如H3K27me3抗體）

洗脫后的DNA進(jìn)行建庫(kù)和測(cè)序

> 注：該抗體已成功應(yīng)用于ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)，文獻(xiàn)中提供了標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)參數(shù)。

應(yīng)用注意事項(xiàng)

1. 超高濃度母液（1000 µg/ml）：本抗體提供濃度顯著高于常規(guī)產(chǎn)品（通常200 µg/ml）。WB使用時(shí)建議至少稀釋2000倍（終濃度0.5 µg/ml），高表達(dá)樣本可稀釋至10,000倍（0.1 µg/ml），大幅節(jié)約抗體用量。IHC從1:500開始優(yōu)化，ChIP-Seq按10 µg/次使用，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)規(guī)模提前分裝。

2. ChIP-Seq專用驗(yàn)證：本品已在Cell期刊發(fā)表的ChIP-Seq研究中得到應(yīng)用（10 µg/反應(yīng)）。這是本抗體的核心功能優(yōu)勢(shì)，可直接參考文獻(xiàn)中的實(shí)驗(yàn)條件，減少摸索時(shí)間。

3. 多平臺(tái)兼容性：經(jīng)驗(yàn)證可用于ChIP、IHC、IP和WB四種應(yīng)用。IHC推薦稀釋范圍1:500-1:2000，建議從1:500開始預(yù)實(shí)驗(yàn)，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度和背景調(diào)整?？乖迯?fù)務(wù)必使用檸檬酸緩沖液（pH 6.0），若信號(hào)弱可嘗試EDTA（pH 8.0），但優(yōu)先檸檬酸。

4. IP實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：按6 µg/mg裂解液用量加入抗體，建議設(shè)置正常兔IgG作為陰性對(duì)照。由于RNF2是PRC1復(fù)合物核心組分，IP后可通過WB檢測(cè)其他PRC1成員（如BMI1、RING1A）驗(yàn)證復(fù)合物完整性。使用Protein A/G瓊脂糖珠捕獲時(shí)，注意洗滌充分以降低非特異性背景。

5. WB稀釋范圍寬：1:2000-1:10,000。RNF2在多種細(xì)胞系（如HeLa、HEK293、MCF-7）中均有表達(dá)，建議從中高稀釋度（1:5000）開始。若檢測(cè)內(nèi)源低表達(dá)水平，可降低稀釋度至1:2000。使用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)時(shí)，曝光時(shí)間可根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整。

6. 儲(chǔ)存與取用：2-8°C恒溫保存，避免反復(fù)開啟和溫度波動(dòng)。本品濃度高，無需分裝，按需吸取即可。請(qǐng)勿冷凍，冷凍會(huì)導(dǎo)致抗體聚集和活性下降，尤其影響ChIP-Seq性能。

7. 疊氮鈉對(duì)HRP及ChIP-Seq的影響：

HRP檢測(cè)：疊氮鈉不可逆抑制辣根過氧化物酶活性。WB實(shí)驗(yàn)中，通過充分洗滌（3次×5分鐘）可有效去除；IHC實(shí)驗(yàn)中，抗原修復(fù)步驟本身可稀釋去除疊氮鈉。

ChIP-Seq：疊氮鈉可能影響染色質(zhì)免疫沉淀效率，建議在抗體稀釋和孵育緩沖液中避免額外添加疊氮鈉。原緩沖液中的0.09%疊氮鈉在10 µg抗體總量中濃度極低（約0.09%×10 µl?實(shí)際抗體體積為10 µl/1000 µg? 需要計(jì)算：1000 µg/ml，10 µg為10 µl，疊氮鈉含量約9 µg，在ChIP反應(yīng)體系（通常500 µl-1 ml）中被充分稀釋至0.0009%-0.0018%，通常不影響。但若擔(dān)心可透析去除。

8. ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照設(shè)置：建議同時(shí)進(jìn)行Input DNA和陰性IgG對(duì)照。使用本抗體獲得的富集區(qū)域應(yīng)與已知PRC1靶基因（如HOX基因簇）進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證。

相關(guān)產(chǎn)品推薦

山羊抗兔IgG重鏈和輕鏈抗體（A120-101P）——用于細(xì)胞裂解液WB檢測(cè)

抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體——用于免疫沉淀物WB檢測(cè)，有效避免重鏈干擾

正常豬血清（S100-020）——用于IP-WB封閉液添加（5%），降低非特異性背景

蛋白A/G磁珠或瓊脂糖珠——用于ChIP和IP實(shí)驗(yàn)中的抗體捕獲