本抗體為艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔源多克隆抗體（貨號(hào)：A301-231A），特異性識(shí)別DNA聚合酶η（PolH）蛋白的C末端區(qū)域（第663位至C末端，精細(xì)表位位于690–713位）。經(jīng)抗原親和純化，提供完整IgG分子形式，未偶聯(lián)任何標(biāo)記物（Unconjugated），濃度為200 µg/mL。適用于免疫沉淀（IP）和蛋白質(zhì)印跡（WB），反應(yīng)種屬為人。

理化參數(shù)

參數(shù)項(xiàng)目 詳細(xì)規(guī)格

目標(biāo)抗原 PolH（DNA聚合酶η）

反應(yīng)種屬 人

宿主來(lái)源 兔

克隆類(lèi)型 多克隆

抗體形式 完整IgG

免疫原 第663位至C末端之間的區(qū)域

精細(xì)表位 第690–713位氨基酸

亞型 IgG

偶聯(lián)物 無(wú)

純度 抗原親和純化

抗原物種 人

濃度 200 µg/mL

保存條件 2–8 °C

有效期限 自收貨起1年

緩沖體系 Tris緩沖鹽水，含0.1% BSA和0.09%疊d化鈉

濃度測(cè)定依據(jù)：采用比爾定律（Beer’s Law），標(biāo)準(zhǔn)為1 mg/mL IgG在280 nm波長(zhǎng)處的吸光值（A280）為1.4。

別名：RAD30、RAD30A、XPV、XP-V、色素性干皮病變異型蛋白。

生產(chǎn)與純化流程

1. 免疫原設(shè)計(jì)：選擇人PolH蛋白C末端第663位至C末端（含690–713位精細(xì)表位）的合成肽段

2. 免疫方案：免疫兔，誘導(dǎo)產(chǎn)生多克隆抗血清

3. 親和純化：將表位特異性肽段固定在固相支持物上，從抗血清中親和捕獲特異性抗體，去除與其他DNA聚合酶（如Polι、Polκ）的交叉反應(yīng)

4. 濃度標(biāo)定：A280法，1 mg/mL對(duì)應(yīng)吸光值1.4

5. 緩沖體系：Tris緩沖鹽水（TBS）含0.1% BSA作為穩(wěn)定蛋白，0.09%疊d化鈉作為防腐劑

注：本品濃度較低（200 µg/mL），但經(jīng)親和純化后特異性高，推薦稀釋倍數(shù)在WB中可達(dá)1:2,000–1:10,000，IP中需按體積計(jì)算用量（30 µL/mg裂解液）。

適用范圍與推薦使用條件

> 重要說(shuō)明：本抗體經(jīng)驗(yàn)證適用于免疫沉淀（IP）和Western blot（WB）。所有WB實(shí)驗(yàn)采用統(tǒng)一封閉和稀釋條件（5%牛奶-TBST，一抗過(guò)夜）。

應(yīng)用技術(shù) 推薦使用條件 備注

免疫沉淀（IP） 6 µg抗體/毫克裂解液 按總蛋白質(zhì)量計(jì)算抗體用量

蛋白質(zhì)印跡（WB） 1:2,000 – 1:10,000 推薦起始稀釋度1:5,000

濃度換算：本品濃度為200 µg/mL，即0.2 µg/µL。進(jìn)行IP時(shí)，如需6 µg抗體/毫克裂解液，則需加入30 µL抗體原液/毫克裂解液。

Western blot 詳細(xì)操作指南

以下操作參數(shù)已由生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證并推薦。

標(biāo)準(zhǔn)WB流程（細(xì)胞裂解液）

樣本制備：

PolH在多種細(xì)胞系中表達(dá)水平中等偏低（相對(duì)于管家蛋白），建議使用含蛋白酶抑制劑的RIPA或NP-40裂解液提取總蛋白

蛋白濃度定量后，加入SDS上樣緩沖液（含DTT或β-巰基乙醇），95°C煮沸5–10分鐘

注意：PolH表達(dá)具有細(xì)胞周期依賴(lài)性（在S期較高），且受DNA損傷誘導(dǎo)（如紫外線處理）。推薦使用UV處理（10–20 J/m2，6–12小時(shí)恢復(fù)）或使用已知高表達(dá)PolH的細(xì)胞系以增強(qiáng)信號(hào)

凝膠電泳：

PolH分子量約78 kDa（實(shí)際預(yù)測(cè)78.3 kDa）

推薦使用8–10% SDS-PAGE分離膠，可清晰分離PolH條帶

上樣量：細(xì)胞裂解液建議40–60 µg總蛋白/泳道（因表達(dá)水平較低，可能需要較大上樣量）

轉(zhuǎn)膜：

PVDF膜（需甲醇活化）或硝酸纖維素膜

濕轉(zhuǎn)條件：恒流250–300 mA，冰浴轉(zhuǎn)膜90分鐘；或4°C過(guò)夜轉(zhuǎn)膜（25–30 V）

轉(zhuǎn)膜后可用麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)膜效率

封閉（生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室參數(shù)）：

封閉液：5% 脫脂牛奶-TBST

封閉條件：室溫?fù)u床1小時(shí)

一抗孵育（生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室參數(shù)）：

稀釋液：5% 脫脂牛奶-TBST

稀釋度：1:2,000 – 1:10,000（推薦起始1:5,000；若信號(hào)弱可降至1:2,000）

孵育條件：4°C過(guò)夜（強(qiáng)烈推薦，低豐度蛋白需延長(zhǎng)孵育時(shí)間）

洗滌：

TBST洗滌3次，每次10分鐘

二抗孵育：

二抗：山羊抗兔IgG（重鏈+輕鏈）HRP偶聯(lián)抗體，貨號(hào) A120-101P（或其他等效產(chǎn)品）

稀釋度：按廠商推薦（通常1:5,000–1:20,000），使用5%牛奶-TBST稀釋

孵育條件：室溫1小時(shí)

洗滌：TBST洗滌3–5次，每次10分鐘

檢測(cè)：

化學(xué)發(fā)光法（ECL），建議使用高靈敏度ECL底物（如SuperSignal West Femto、Pierce ECL Plus），因PolH表達(dá)豐度較低，常規(guī)ECL可能信號(hào)不足

曝光時(shí)間：初次嘗試可曝光30秒、1分鐘、5分鐘，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)度調(diào)整

免疫沉淀后Western blot的特殊要求

當(dāng)本抗體用于免疫沉淀實(shí)驗(yàn)，隨后對(duì)免疫沉淀復(fù)合物進(jìn)行Western blot檢測(cè)時(shí)，洗脫產(chǎn)物中包含用于IP的抗體（兔IgG）的重鏈（約55 kDa）和輕鏈（約25 kDa）。PolH分子量約78 kDa，介于重鏈（55 kDa）和輕鏈（25 kDa）之間，但重鏈55 kDa與PolH 78 kDa有一定距離，通常常規(guī)IP-WB使用抗兔H+L二抗產(chǎn)生的重鏈信號(hào)不會(huì)直接覆蓋PolH條帶。然而，如果檢測(cè)PolH的修飾形式或互作蛋白分子量接近55 kDa，則可能產(chǎn)生干擾。

優(yōu)化方案（生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)室推薦，尤其適用于多重檢測(cè)或高靈敏度需求）：

1. 二抗選擇：使用抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體（僅識(shí)別兔IgG輕鏈，不識(shí)別重鏈）

2. 封閉緩沖液補(bǔ)充：在封閉液中加入5% 正常豬血清（貨號(hào) S100-020）

操作步驟（IP-WB）：

完成免疫沉淀后，將洗脫樣本煮沸變性，進(jìn)行SDS-PAGE（8–10%凝膠）

轉(zhuǎn)膜后，封閉液使用含5%正常豬血清的5%牛奶-TBST

一抗孵育：本抗體（1:5,000），用含5%正常豬血清的封閉液稀釋?zhuān)?°C過(guò)夜

二抗孵育：抗兔IgG輕鏈HRP抗體（1:5,000–1:10,000），室溫1小時(shí)

檢測(cè)：高靈敏度ECL

儲(chǔ)存與穩(wěn)定性

儲(chǔ)存條件：

溫度：2–8°C（嚴(yán)禁冷凍，冷凍會(huì)導(dǎo)致抗體蛋白變性及活性喪失）

防腐劑：0.09%疊d化鈉

穩(wěn)定蛋白：0.1% BSA防止低濃度抗體吸附損失

分裝建議：本品濃度較低，建議避免頻繁開(kāi)蓋，可分裝為25–50 µL/管，仍?xún)?chǔ)存于2–8°C（不建議-20°C）

有效期：自收貨之日起12個(gè)月。

失效跡象：

出現(xiàn)明顯沉淀（BSA可能形成微量沉淀，離心后測(cè)試；大量沉淀則廢棄）

陽(yáng)性對(duì)照樣本（UV處理的HeLa裂解液）WB信號(hào)顯著下降或消失

IP-WB背景異常升高