產(chǎn)品核心特性

由艾美捷Bethyl Laboratories推出的抗HIF2?α抗體（貨號(hào)A700-003，克隆號(hào)BL-95-1A2）是一款重組兔單克隆抗體，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)上清純化，以Whole IgG形式提供。該抗體針對(duì)人源缺氧誘導(dǎo)因子2α（HIF2?α，又稱EPAS1）設(shè)計(jì)，在多種應(yīng)用中表現(xiàn)優(yōu)異，包括染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）、免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC）、免疫熒光（ICC-IF）、免疫組化（IHC）、免疫沉淀（IP）及免疫印跡（WB）。關(guān)鍵參數(shù)如下：

參數(shù) 詳細(xì)信息

靶點(diǎn) HIF2?α / EPAS1

反應(yīng)性 人

宿主 兔

克隆性 重組單克?。寺√?hào) BL-95-1A2）

格式 Whole IgG

濃度 400 µg/ml

純化方式 從細(xì)胞培養(yǎng)上清純化

同種型 IgG

偶聯(lián)物 未偶聯(lián)

儲(chǔ)存 2 - 8°C

有效期 1年

緩沖液 PBS，含0.1% BSA及0.09%疊d化鈉

免疫原與表位特異性

該抗體識(shí)別表位位于人HIF2?α蛋白第400至450位殘基之間（參考序列NP_001421.2，GeneID 2034）。這一區(qū)域位于HIF2?α的C端轉(zhuǎn)錄激活域（TAD）與ODD域（氧依賴降解域）之間，具有較高的抗原性且與其他bHLH-PAS家族成員（如HIF1?α）的序列差異明顯，因此可實(shí)現(xiàn)特異性識(shí)別。

生產(chǎn)優(yōu)勢(shì)：作為重組單克隆抗體，A700-003由穩(wěn)定細(xì)胞系表達(dá)，避免了傳統(tǒng)多克隆抗體的批次間差異，確保長(zhǎng)期供應(yīng)的一致性和可重復(fù)性?？贵w經(jīng)親和純化后濃度高達(dá)400 µg/ml，為下游多種高靈敏度應(yīng)用提供了充足保障。

儲(chǔ)存與穩(wěn)定性

儲(chǔ)存條件：2 - 8°C，禁止冷凍。

有效期：自收貨之日起1年。

緩沖液組成：磷酸鹽緩沖鹽水（PBS），含0.1% BSA及0.09%疊d化鈉（防腐劑）。

應(yīng)用方法與推薦參數(shù)

以下應(yīng)用均經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，用戶可依據(jù)推薦條件直接使用或進(jìn)行微調(diào)。

通用實(shí)驗(yàn)條件

所有Western Blot實(shí)驗(yàn)均采用5% Milk-TBST作為封閉液和抗體稀釋液，一抗孵育過(guò)夜（4°C搖動(dòng)）。

檢測(cè)二抗：

細(xì)胞裂解液WB：羊抗兔IgG重鏈+輕鏈抗體（A120-101P）

IP洗脫液WB：抗兔IgG輕鏈HRP偶聯(lián)抗體 + 5%正常豬血清（S100-020）封閉

各應(yīng)用推薦參數(shù)

應(yīng)用 推薦稀釋度/用量 關(guān)鍵條件提示

ChIP-Seq 10 - 40 µl / 30 µg 染色質(zhì) 過(guò)往批次已驗(yàn)證適用于ChIP-Seq

免疫細(xì)胞化學(xué)（ICC） 1:200 - 1:1000 甲醛固定，Triton X-100通透

免疫熒光（ICC-IF） 1:100 - 1:500 同上

免疫組化（IHC） 1:200 - 1:1000 FFPE切片需用枸櫞酸鹽緩沖液pH 6.0高壓修復(fù)20分鐘，建議一抗過(guò)夜孵育

免疫沉淀（IP） 20 µl / mg 裂解物 本品為高濃度抗體，按體積而非質(zhì)量添加

免疫印跡（WB） 1:1000 過(guò)夜孵育，建議使用同步化細(xì)胞或缺氧處理的陽(yáng)性對(duì)照

詳細(xì)操作要點(diǎn)

ChIP-Seq：該抗體過(guò)往批次已成功用于ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)。推薦投入10-40 µl抗體與30 µg染色質(zhì)共孵育。用戶在使用新批次時(shí)應(yīng)進(jìn)行qPCR預(yù)驗(yàn)證（如檢測(cè)HIF2?α靶基因VEGF、EPO的啟動(dòng)子富集）?？贵w濃度較高（400 µg/ml），建議進(jìn)行小規(guī)模預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳用量。

ICC / ICC-IF：采用4%甲醛室溫固定細(xì)胞10-15分鐘，PBS洗滌后使用0.1-0.5% Triton X-100通透5-10分鐘。一抗稀釋于含1% BSA的PBS中，4°C孵育過(guò)夜。推薦使用Alexa Fluor偶聯(lián)的羊抗兔二抗進(jìn)行熒光檢測(cè)。陽(yáng)性對(duì)照可使用低氧（1% O?）處理24小時(shí)的HeLa或786-O細(xì)胞（后者因VHL缺失而組成型表達(dá)HIF2?α）。

IHC（石蠟切片）：必須進(jìn)行熱誘導(dǎo)抗原修復(fù)。推薦使用壓力鍋或微波爐加熱枸櫞酸鹽緩沖液（pH 6.0）至沸騰后維持20分鐘。自然冷卻至室溫后，進(jìn)行封閉和一抗孵育（4°C過(guò)夜）。使用HRP標(biāo)記的二抗和DAB顯色。陽(yáng)性組織推薦人腎透明細(xì)胞癌或肝細(xì)胞癌切片。

IP：按20 µl抗體/mg總蛋白裂解物的比例加入。由于該抗體濃度高（400 µg/ml），20 µl對(duì)應(yīng)8 µg抗體，與常規(guī)IP用量相當(dāng)。推薦使用非變性裂解液（如1% NP-40，150 mM NaCl，50 mM Tris pH 7.4，蛋白酶抑制劑）。4°C旋轉(zhuǎn)孵育2-4小時(shí)，加入Protein A磁珠繼續(xù)孵育1-2小時(shí)。洗滌后，用SDS上樣緩沖液洗脫。

WB：推薦起始稀釋比為1:1000。HIF2?α分子量約為100-120 kDa（依賴于磷酸化和氧濃度）。注意：在常氧條件下，HIF2?α被VHL/E3泛素連接酶識(shí)別并迅速降解，因此WB檢測(cè)需使用低氧處理或脯氨酰羥化酶抑制劑（如DMOG、CoCl?）處理的細(xì)胞裂解液。陽(yáng)性對(duì)照：CoCl?（100-200 µM，4-6小時(shí)）處理的HeLa細(xì)胞，或組成型表達(dá)HIF2?α的786-O細(xì)胞。

別名

basic-helix-loop-helix-PAS protein MOP2、bHLHe73、class E basic helix-loop-helix protein 73、ECYT4、EPAS-1、HIF-1-alpha-like factor、HIF-1α-like factor、HIF2A、HIF-2-alpha、HIF2-alpha、HLF、hypoxia-inducible factor 2 alpha、Hypoxia-inducible factor 2-alpha、member of PAS protein 2、MOP2、PAS domain-containing protein 2、PASD2

使用注意事項(xiàng)

1.防腐劑：緩沖液含0.09%疊d化鈉，有毒性，操作時(shí)需佩戴防護(hù)用具。疊d化鈉會(huì)抑制HRP活性，若用于HRP檢測(cè)體系，需確保在封閉和洗滌步驟中充分去除（增加洗滌次數(shù)或使用不含疊d化鈉的緩沖液稀釋抗體）。

2.氧濃度控制：HIF2?α在常氧下極不穩(wěn)定，處理細(xì)胞樣品時(shí)需嚴(yán)格把控氧濃度。建議在缺氧工作站（1% O?）或使用化學(xué)穩(wěn)定劑（如CoCl?，100 µM處理4-6小時(shí)；或DMOG，1 mM處理4小時(shí)）收集裂解物。裂解緩沖液中應(yīng)添加蛋白酶抑制劑和去泛素化酶抑制劑（如N-乙基馬來(lái)酰亞胺）。

3.陽(yáng)性對(duì)照推薦：

WB：CoCl?處理的HeLa裂解物，或786-O細(xì)胞裂解物（組成型表達(dá)）。

IHC：人腎透明細(xì)胞癌組織（VHL突變，HIF2?α核陽(yáng)性）。

ICC-IF：低氧處理的786-O或Hep3B細(xì)胞。

4.分子量確認(rèn)：HIF2?α在SDS-PAGE中遷移位置約為100-120 kDa。由于磷酸化修飾，可能出現(xiàn)雙條帶或彌散。使用未處理與磷酸酶處理樣本對(duì)比可輔助條帶鑒定。

5.ChIP實(shí)驗(yàn)優(yōu)化：初次使用建議設(shè)置10 µl、20 µl、40 µl三個(gè)抗體用量梯度。同時(shí)使用陰性對(duì)照（兔IgG）和陽(yáng)性對(duì)照抗體（如抗H3K4me3）。固定時(shí)間（甲醛1%室溫10分鐘）和染色質(zhì)剪切長(zhǎng)度（200-700 bp）需預(yù)先優(yōu)化。

6.交叉反應(yīng)性：已驗(yàn)證人反應(yīng)性。經(jīng)序列比對(duì)，小鼠Hif2α（NP_034269.2）在400-450區(qū)域同源性約85%，該抗體對(duì)小鼠樣本的交叉反應(yīng)性未經(jīng)驗(yàn)證。如需檢測(cè)小鼠，建議預(yù)先通過(guò)WB驗(yàn)證。