Western免疫印跡（Western Blot）是將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上，然后利用抗體進(jìn)行檢測的方法。對已知表達(dá)蛋白，可用相應(yīng)抗體作為一抗進(jìn)行檢測，對新基因的表達(dá)產(chǎn)物，可通過融合部分的抗體檢測。

與Southern或Northern雜交方法類似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝膠電泳，被檢測物是蛋白質(zhì)，“探針”是抗體，“顯色”用標(biāo)記的二抗。

經(jīng)過PAGE分離的蛋白質(zhì)樣品，轉(zhuǎn)移到固相載體（例如硝酸纖維素薄膜）上，固相載體以非共價鍵形式吸附蛋白質(zhì)，且能保持電泳分離的多肽類型及其生物學(xué)活性不變。以固相載體上的蛋白質(zhì)或多肽作為抗原，與對應(yīng)的抗體起免疫反應(yīng)，再與酶或同位素標(biāo)記的第二抗體起反應(yīng)，經(jīng)過底物顯色或放射自顯影以檢測電泳分離的特異性目的基因表達(dá)的蛋白成分。該技術(shù)也廣泛應(yīng)用于檢測蛋白水平的表達(dá)。

1.  一抗、二抗的稀釋度、作用時間和溫度對不同的蛋白要經(jīng)過預(yù)實驗確定*條件。
 

2.  顯色液必須新鮮配置使用，zui后加入H₂O₂。
 

3.  DAB有致癌的潛在可能，操作時要小心仔細(xì)。

實驗方法

一、免疫反應(yīng)
 

1.  用0.01 M PBS洗膜，5 min ×3次。
 

2.  加入包被液，平穩(wěn)搖動，室溫2 h。
 

3.  棄包被液，用0.01 M PBS洗膜，5 min×3次。
 

4.  加入一抗（按合適稀釋比例用0.01 M PBS稀釋，液體必須覆蓋膜的全部），4℃ 放置12 h以上。陰性對照，以1%BSA取代一抗，其余步驟與實驗組相同。
 

5.  棄一抗和1%BSA，用0.01 M PBS分別洗膜，5 min×4次。
 

6.  加入辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗（按合適稀釋比例用0.01 M  PBS稀釋），平穩(wěn)搖動，室溫2 h。
 

7.  棄二抗，用0.01 M PBS洗膜，5 min×4次。
 

8.  加入顯色液，避光顯色至出現(xiàn)條帶時放入雙蒸水中終止反應(yīng)。