ELISPOT（酶聯(lián)免疫斑點技術，Enzyme-Linked Immunospot Assay）是一種高度靈敏的免疫學檢測技術，用于檢測和量化分泌特定細胞因子（如IFN-γ）的單個T細胞。在結核病領域，它被開發(fā)為結核感染T細胞斑點試驗（T-SPOT.TB），是γ-干擾素釋放試驗（IGRA） 的一種。

熒光斑點	明場斑點	全自動酶聯(lián)免疫斑點分析儀

一、ELISPOT用于TB診斷的基本原理

其核心原理是檢測人體免疫系統(tǒng)對結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）特異性抗原的反應。

1. 樣本采集：從患者外周血中分離出外周血單核細胞（PBMCs），這些細胞中包含T淋巴細胞。

2. 刺激培養(yǎng)：將PBMCs分別與以下物質(zhì)在包被了抗IFN-γ抗體的微孔板中共同孵育：

• ESAT-6 和 CFP-10：這是兩種關鍵的MTB特異性抗原。它們存在于結核分枝桿菌復合群（包括MTB、牛分枝桿菌等）中，但不存在于絕大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌和卡介苗（BCG） 中。這是IGRA技術區(qū)別于傳統(tǒng)結核菌素皮試（TST）的關鍵優(yōu)勢。

• 陽性對照（如植物血凝素PHA）：用于確認細胞具有正常的反應能力。

• 陰性對照（培養(yǎng)基）：用于排除非特異性背景反應。

3. 細胞因子捕獲與顯色：如果體內(nèi)存在致敏的T細胞（即曾經(jīng)感染過MTB），在遇到ESAT-6或CFP-10后，會被激活并大量分泌IFN-γ。IFN-γ立即被板底預包被的抗體所捕獲。洗去細胞后，加入酶標記的二抗和底物進行顯色反應。

4. 結果判讀：在每個被激活的T細胞所在的位置，會形成一個不溶性的彩色斑點（Spot）。一個斑點代表一個對MTB抗原發(fā)生反應的T細胞。通過Bioreader 7000計數(shù)斑點的數(shù)量，即可對反應強度進行量化。

二、ELISPOT (T-SPOT.TB) 的優(yōu)勢

與傳統(tǒng)的結核菌素皮試（TST）相比，ELISPOT具有顯著優(yōu)點：

1. 高特異性：由于使用的抗原ESAT-6和CFP-10不在BCG和大多數(shù)環(huán)境分枝桿菌中存在，因此接種過BCG的人不會出現(xiàn)假陽性結果。這大大提高了診斷的特異性。

2. 高靈敏度：特別適用于免疫抑制人群（如HIV感染者）的結核感染篩查，其靈敏度通常高于TST。

3. 客觀量化：結果是數(shù)字化的斑點計數(shù)，客觀性強，避免了TST結果判讀的主觀性。

4. 快速便捷：整個過程在體外進行，僅需一次抽血，24-48小時內(nèi)即可獲得結果?；颊邿o需再次回訪。

5. 區(qū)分潛伏性感染與活動性結核：雖然不能WAN全區(qū)分，但通?；顒有越Y核病患者的斑點計數(shù)會顯著高于潛伏性感染（LTBI）者，但仍需結合臨床癥狀和其他檢查綜合判斷。

三、在TB診斷中的應用場景

1. 潛伏性結核感染（LTBI）的診斷和篩查：這是ELISPOT最主要的應用。用于篩查結核病高危人群，如HIV感染者、QI官YI植前患者、準備接受抗TNF-α治療的患者等，以便進行預防性治療。

2. 活動性結核病的輔助診斷：

• 對于菌陰肺結核、肺外結核（如結核性胸膜炎、結核性腦膜炎、淋巴結結核等）等難以通過病原學確診的病例，ELISPOT提供重要的輔助診斷依據(jù)。

• 注意：ELISPOT陽性不能區(qū)分是LTBI還是活動性結核，必須結合患者的臨床表現(xiàn)、影像學、病原學等結果綜合判斷。

3. 排除結核病：在低流行區(qū)，ELISPOT陰性結果對于排除結核感染具有很高的價值。

四、局限性及注意事項

1. 不能區(qū)分潛伏感染與活動性結核：這是所有IGRA技術的共同局限。陽性結果只表明感染了MTB，但不能確定是潛伏狀態(tài)還是活動狀態(tài)。

2. 成本高昂：檢測所需的試劑和設備昂貴，操作技術要求高，限制了其在資源匱乏地區(qū)的應用。

3. 操作復雜：需要無菌分離PBMCs，流程步驟多，對實驗室條件有要求。

4. 存在假陰性和假陽性的可能：

• 假陰性：見于極度免疫抑制的患者（如CD4計數(shù)極低的AIDS患者）、淋巴細胞數(shù)量顯著減少、操作失誤（如細胞活力不足）等。

• 假陽性：極少數(shù)非結核分枝桿菌（如堪薩斯分枝桿菌、海分枝桿菌等）也含有ESAT-6或CFP-10基因，可能導致交叉反應。

5. 不確定結果：有時陰性對照孔斑點過多或陽性對照孔無反應，會導致結果無法判讀，需要重新抽血檢測。

五、實驗流程簡要總結

1. 抽血：采集患者外周靜脈血于肝素鈉抗凝管中。

2. 分離PBMCs：使用密度梯度離心法（如Ficoll）分離PBMCs。

3. 計數(shù)與調(diào)整濃度：對PBMCs進行計數(shù)，并將其濃度調(diào)整到標準要求。

4. 加樣與刺激：將細胞懸液加入預先包被好抗體的孔板中，并分別加入刺激物（抗原A、抗原B、陽性對照、陰性對照）。

5. 孵育：在37°C，5% CO?培養(yǎng)箱中孵育16-20小時。

6. 顯色：洗去細胞后，依次加入生物素化檢測抗體、酶標記鏈霉親和素、底物溶液進行顯色。

7. 計數(shù)與分析：反應終止后，使用自動ELISPOT讀板機Bioreader 7000計數(shù)斑點，并根據(jù)試劑盒提供的算法判定結果（陽性、陰性或不確定）。

結論

ELISPOT技術（以T-SPOT.TB為代表）是結核病診斷領域的一項重要進步。它以其高特異性和高靈敏度，成為了篩查潛伏性結核感染和輔助診斷活動性結核病，特別是對于免疫抑制人群和難以確診的肺外結核的寶貴工具。然而，臨床醫(yī)生必須理解其局限性，始終將其作為綜合診斷策略的一部分，而非wei一的診斷依據(jù)。