一、 實(shí)驗(yàn)原理

BCA是一種堿性的水溶性復(fù)合物，性質(zhì)穩(wěn)定。在其提供的堿性環(huán)境下，蛋白質(zhì)可以將BCA試劑中的Cu²⁺還原為Cu⁺，Cu⁺繼而與BCA試劑螯合，從而產(chǎn)生藍(lán)紫色的絡(luò)合物，在562nm波長(zhǎng)處具有強(qiáng)吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光度，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得知蛋白濃度。BCA法因抗干擾性強(qiáng)、簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，靈敏度高而得到廣泛應(yīng)用，但其也易受溫度、孵育時(shí)間的影響。

二、 實(shí)驗(yàn)步驟（視試劑盒而定）

1) 蛋白標(biāo)準(zhǔn)品配制

室溫溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品,取20µl 5mg/ml BSA蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液用PBS溶液稀釋至100µl,使其終濃度為1.0 mg/ml。

2) 配制BSA標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定溶液

3) 工作液配制

將A液與B液按照50:1的比例混合，配成BCA工作液，并混勻。注：此處一定要精準(zhǔn)計(jì)算待測(cè)孔所用工作液的量，如測(cè)定4個(gè)蛋白樣本，均做3個(gè)復(fù)孔，那么加上標(biāo)曲一共有39孔，每個(gè)測(cè)定孔均需加入200µl的工作液，那么共需7800µl工作液，則A液：B液=7800:156。

4) 加樣

按照第二步所示表格加標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定孔，將待測(cè)樣本以適當(dāng)體積加入并用PBS補(bǔ)足至20ul（待測(cè)樣本加入的量可按照經(jīng)驗(yàn)值進(jìn)行估計(jì)）。

5) 孵育

6) 測(cè)吸光度

7) 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度

 注：此處進(jìn)行了一個(gè)單位的換算，這個(gè)可根據(jù)大家的個(gè)人習(xí)慣來(lái)

b.選中標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度和濃度，點(diǎn)擊“插入"，選擇散點(diǎn)圖；

c.點(diǎn)擊散點(diǎn)圖上的任意一點(diǎn)，右鍵選擇添加趨勢(shì)線

d.點(diǎn)擊設(shè)置，趨勢(shì)線選項(xiàng)選擇“線性"，勾選“顯示公式"和“顯示R平方值"，即可得到標(biāo)準(zhǔn)曲線；

        注：橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為濃度，R²需要大于0.99方可使用

e.計(jì)算樣本濃度：代入公式直接計(jì)算即可，但要記得樣本稀釋倍數(shù)再給還原回去哦。

三、 注意事項(xiàng)

1)標(biāo)準(zhǔn)品可現(xiàn)配現(xiàn)用，也可配制后在-20℃保存一年，但工作液需要現(xiàn)配現(xiàn)用。

2)為保證蛋白濃度測(cè)量的準(zhǔn)確性，最好做3個(gè)復(fù)孔，必要時(shí)剔除離群值。

3)BCA法測(cè)蛋白濃度易受時(shí)間及溫度的影響，所以最好每次測(cè)定都做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

4)在制作標(biāo)曲時(shí)，一定要分清橫縱坐標(biāo)哪個(gè)代表濃度哪個(gè)代表吸光度，不要搞錯(cuò)。

5)加樣時(shí)一定要準(zhǔn)確加樣且盡可能避免氣泡產(chǎn)生，以免影響測(cè)量（加樣結(jié)束可以用注射器戳破氣泡，并將96孔板放在搖床上混勻片刻，以使樣品與工作液充分接觸）。

6)孵育結(jié)束應(yīng)盡快檢測(cè)吸光度，并盡可能加快檢測(cè)速度，以免帶來(lái)誤差。

7)一般情況下，樣品的蛋白濃度是比較高的，需要用PBS溶液進(jìn)行稀釋后測(cè)量，稀釋倍數(shù)可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)值進(jìn)行調(diào)整，保證濃度測(cè)量在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)進(jìn)行。