本文要點(diǎn)：本研究開發(fā)了一種腫瘤靶向納米抗體平臺(tái)，通過白蛋白結(jié)合和染料封裝實(shí)現(xiàn)近紅外二區(qū)（NIR-II）成像引導(dǎo)的光動(dòng)力治療。該平臺(tái)通過基因工程改造納米抗體使其與人血清白蛋白（HSA）特異性結(jié)合，形成單分散遞送載體。白蛋白空腔封裝IR808染料后，在808 nm激光激發(fā)下可同步增強(qiáng)NIR-II熒光與單線態(tài)氧生成。這種親和力驅(qū)動(dòng)的自組裝技術(shù)構(gòu)建了均質(zhì)性納米抗體-白蛋白復(fù)合平臺(tái)，其中白蛋白結(jié)合使納米抗體藥代動(dòng)力學(xué)顯著改善，腫瘤蓄積量遠(yuǎn)超清除器官滯留量。在結(jié)直腸癌移植瘤模型中，僅需420 J/cm2的低劑量近紅外光照射即可實(shí)現(xiàn)高對(duì)比度NIR-II成像與高效光動(dòng)力治療。該研究凸顯了自組裝納米抗體平臺(tái)的生物衍生特性與療效，為設(shè)計(jì)精準(zhǔn)診療劑提供了新策略。

活體成像

本文研發(fā)了一種腫瘤靶向納米抗體平臺(tái)，該平臺(tái)通過白蛋白與染料結(jié)合進(jìn)行封裝，利用近紅外二區(qū)（NIR-II）成像引導(dǎo)光動(dòng)力治療。構(gòu)建腫瘤靶向納米抗體-白蛋白平臺(tái)的策略如方案1所示。前期研究表明，通過基因工程引入白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（ABD）的納米抗體可借助內(nèi)源性白蛋白結(jié)合延長(zhǎng)血液循環(huán)時(shí)間。本研究利用納米抗體-白蛋白結(jié)合與白蛋白-染料封裝技術(shù)，組裝出用于NIR-II成像引導(dǎo)光動(dòng)力治療的診療一體化平臺(tái)。研究者篩選了兩種近紅外花菁染料（含氯IR808與無氯ICG）進(jìn)行HSA封裝，并系統(tǒng)考察HSA-染料探針的光物理性質(zhì)。值得注意的是，在近紅外光激發(fā)下，該染料的熒光亮度、光穩(wěn)定性及單線態(tài)氧生成效率均獲得顯著提升。荷瘤小鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)顯示，相較于單純白蛋白遞送系統(tǒng)，該納米抗體平臺(tái)具有顯著的腫瘤靶向蓄積特性，光動(dòng)力治療效果大幅增強(qiáng)。本研究為開發(fā)兼具高特異性與高載藥能力的生物基診療一體化平臺(tái)提供了創(chuàng)新方案。

方案1. NIR-II成像和光動(dòng)力治療的具有增強(qiáng)熒光亮度和單線態(tài)氧產(chǎn)生的腫瘤靶向納米體HSA治療平臺(tái)的構(gòu)建示意圖

染料與HSA按不同分子比在50℃孵育2小時(shí)完成封裝（圖1a），采用十二烷基*聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析不同摩爾比的HSA-染料復(fù)合物。由于SDS-PAGE會(huì)使蛋白質(zhì)變性并破壞白蛋白疏水腔結(jié)構(gòu)，該方法可有效表征染料封裝機(jī)制。如圖1b所示，HSA-IR808電泳條帶呈現(xiàn)強(qiáng)烈熒光信號(hào)，證實(shí)IR808與HSA形成穩(wěn)定復(fù)合物；而HSA-ICG條帶熒光信號(hào)可忽略，表明其在SDS-PAGE處理過程中發(fā)生解離。該現(xiàn)象與既往研究一致：含氯菁染料可通過與疏水腔內(nèi)半胱氨酸殘基共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定熒光復(fù)合物。值得注意的是，當(dāng)IR808與HSA摩爾反應(yīng)比為2:1時(shí)，HSA-IR808復(fù)合物熒光強(qiáng)度達(dá)到峰值，提示白蛋白空腔達(dá)到染料封裝飽和。最終選擇2:1摩爾比的HSA-IR808復(fù)合物進(jìn)行后續(xù)研究。

采用紫外-可見吸收光譜和熒光光譜對(duì)HSA-IR808復(fù)合物的光物理性質(zhì)進(jìn)行表征。紫外-可見光譜顯示，與游離IR808相比，HSA-IR808復(fù)合物的吸收峰出現(xiàn)20 nm的紅移，且溶液顏色因近紅外吸收增強(qiáng)而發(fā)生顯著變化（圖1c）。熒光光譜中同樣觀察到發(fā)射紅移，且熒光強(qiáng)度大幅提升（圖1d）。這一現(xiàn)象歸因于染料分子與白蛋白Trp214殘基之間形成大π-π共軛體系，降低了最高占據(jù)分子軌道-未占據(jù)分子軌道（HOMO-LUMO）能隙，從而誘導(dǎo)吸收波長(zhǎng)紅移。此外，研究表明白蛋白對(duì)水溶液中的菁染料具有雙重保護(hù)作用，既能防止聚集，又可限制光照下的光氧化裂解反應(yīng)?；诖诵?yīng)，本文考察了HSA-IR808在連續(xù)激光照射下的光穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，10分鐘激光照射后，游離IR808的熒光強(qiáng)度降至初始值的10%左右，而HSA-IR808仍保持75%以上的熒光強(qiáng)度（圖1e），表明其光穩(wěn)定性顯著改善。綜上，白蛋白封裝可有效提升近紅外染料熒光亮度與光穩(wěn)定性。接著研究者進(jìn)一步探究了白蛋白封裝對(duì)菁染料單線態(tài)氧生成及光動(dòng)力治療效果的影響。采用單線態(tài)氧熒光探針（SOSG）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在808 nm激光照射下，HSA-IR808溶液中的SOSG熒光強(qiáng)度在120秒內(nèi)顯著增強(qiáng)（圖1f），表明封裝染料能有效產(chǎn)生單線態(tài)氧；而游離IR808和ICG溶液中的SOSG熒光僅微弱增加（圖1g、1h），PBS對(duì)照組則無變化。定量分析顯示，白蛋白封裝使單線態(tài)氧生成效率提升至游離IR808的3倍（圖1i），其量子產(chǎn)率達(dá)到約0.5%。

盡管白蛋白封裝能顯著提升熒光團(tuán)的亮度、穩(wěn)定性和單線態(tài)氧生成能力，但天然白蛋白載體在體內(nèi)常面臨腫瘤靶向性不足的挑戰(zhàn)。前期開發(fā)的抗CD47納米抗體-白蛋白結(jié)合域融合蛋白（Nb-ABD）能通過結(jié)合白蛋白延長(zhǎng)納米抗體的體內(nèi)半衰期，其對(duì)多種白蛋白亞型均表現(xiàn)出強(qiáng)結(jié)合親和力，其中對(duì)人血清白蛋白（HSA）的親和力最高。本研究利用這一特性，通過Nb-ABD與HSA-IR808分子的自組裝構(gòu)建納米抗體-白蛋白平臺(tái)（Nb-HSA-IR808）（圖2a）。采用分子排阻色譜（SEC）分析1:1摩爾比的Nb-ABD與HSA復(fù)合情況，結(jié)果顯示在50 mL保留體積處出現(xiàn)單一蛋白峰（圖2b），其分子量大于游離HSA；而2:1混合體系則同時(shí)存在Nb-HSA復(fù)合物和游離Nb-ABD。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，Nb-HSA復(fù)合物在PBS或50%胎牛血清（FBS）中37℃孵育48小時(shí)后，PBS組保持復(fù)合狀態(tài)，50% FBS組復(fù)合率仍超過90%（圖2c）。動(dòng)態(tài)光散射（DLS）檢測(cè)顯示Nb-HSA復(fù)合物粒徑較游離HSA略有增大（圖2d），與SEC結(jié)果一致，證實(shí)該平臺(tái)具有高效自組裝性、產(chǎn)物均一性和生理環(huán)境穩(wěn)定性。

圖3. Nb-HSA-IR808探針的體外細(xì)胞光毒性測(cè)定

研究者隨后通過將癌細(xì)胞與IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808共培養(yǎng)，評(píng)估了納米抗體-白蛋白探針的光動(dòng)力效應(yīng)。在無光照條件下，三種探針在0-20 μM濃度范圍內(nèi)均未表現(xiàn)出顯著細(xì)胞毒性（圖3a）。但經(jīng)808 nm激光照射10分鐘后，觀察到明顯的濃度依賴性光毒性效應(yīng)（圖3b）。當(dāng)濃度超過10 μM時(shí)，Nb-HSA-IR808處理組的光毒性顯著高于游離IR808或HSA-IR808組，證實(shí)納米抗體靶向作用增強(qiáng)了光動(dòng)力療效。活/死細(xì)胞染色結(jié)果與細(xì)胞活性檢測(cè)一致：無光照時(shí)各組細(xì)胞均保持高活性（圖3c）；激光照射后，Nb-HSA-IR808組顯示出強(qiáng)烈的死細(xì)胞信號(hào)。PBS對(duì)照組在光照后仍維持高細(xì)胞存活率，排除了實(shí)驗(yàn)所用激光劑量本身的細(xì)胞毒性。結(jié)果共同證明，Nb-HSA-IR808探針在光動(dòng)力治療領(lǐng)域具有重要應(yīng)用潛力。

圖4. Nb-HSA探針的體內(nèi)生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)

由于分子量較小，游離納米抗體易通過腎臟快速清除，導(dǎo)致體內(nèi)循環(huán)時(shí)間較短（51,52）。研究者通過小鼠模型研究了納米抗體-白蛋白平臺(tái)的藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布特性。首先采用Cy5.5-NHS酯標(biāo)記Nb-ABD蛋白并組裝成Nb-Cy5.5-HSA探針?；铙w熒光成像顯示（圖4a），靜脈注射Nb-Cy5.5-HSA的小鼠在5分鐘內(nèi)即出現(xiàn)明顯的肝臟富集，而游離Nb-Cy5.5主要蓄積于膀胱區(qū)域。定量分析表明，注射后6小時(shí)內(nèi)Nb-Cy5.5-HSA組的肝臟信號(hào)強(qiáng)度顯著高于游離納米抗體組（圖4b、4c）。離體器官成像進(jìn)一步證實(shí)，注射6小時(shí)后Nb-Cy5.5-HSA主要分布于肝臟，而游離納米抗體則集中于腎臟（圖4d、4e）。藥代動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，HSA結(jié)合使納米抗體的血漿半衰期從0.2小時(shí)延長(zhǎng)至1.5小時(shí)，增幅達(dá)7.5倍（圖4f）。這些結(jié)果共同表明，白蛋白結(jié)合通過將納米抗體的清除途徑從腎臟快速排泄轉(zhuǎn)為肝臟代謝，顯著延長(zhǎng)了其體內(nèi)循環(huán)時(shí)間。

圖5. 皮下LS174T腫瘤小鼠的熒光成像

本研究采用結(jié)直腸癌異種移植小鼠模型，評(píng)估了Nb-HSA-IR808探針的體內(nèi)腫瘤靶向能力。在靜脈注射等染料濃度的IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808探針后，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行了24小時(shí)近紅外二區(qū)（NIR-II）熒光成像監(jiān)測(cè)。如圖5a所示，三組動(dòng)物的腫瘤部位熒光信號(hào)在12小時(shí)內(nèi)持續(xù)增強(qiáng)，并在24小時(shí)內(nèi)保持相對(duì)穩(wěn)定。值得注意的是，Nb-HSA-IR808組的腫瘤信號(hào)強(qiáng)度較游離IR808和HSA-IR808組提高1.5倍（圖5b）。HSA-IR808與游離IR808在腫瘤部位的信號(hào)強(qiáng)度相近，可能與血液中內(nèi)源性白蛋白對(duì)IR808的包裹作用有關(guān)。Nb-HSA-IR808組的腫瘤-肌肉信號(hào)比值較其他兩組高出1.6倍以上（圖5c），凸顯了該探針在熒光引導(dǎo)光動(dòng)力治療中優(yōu)異的NIR-II成像對(duì)比度。離體器官成像顯示（圖5d、5e），三種探針在主要臟器的分布相似，但Nb-HSA-IR808在腫瘤組織的信號(hào)強(qiáng)度比游離IR808和HSA-IR808高約1.6倍。尤為重要的是，Nb-HSA-IR808組腫瘤的熒光信號(hào)甚至超過肝臟、腎臟等清除器官，充分證明納米抗體-白蛋白平臺(tái)腫瘤靶向性能。腫瘤組織的免疫組化結(jié)果（圖5f）顯示CD47高表達(dá)，為納米抗體探針的高靶向特異性提供了分子基礎(chǔ)。

圖6. Nb-HSA-IR808探針體內(nèi)抗腫瘤療效評(píng)價(jià)

本文在結(jié)直腸癌異種移植模型中評(píng)估了Nb-HSA-IR808探針的光動(dòng)力治療效果。將5×106個(gè)LS174T細(xì)胞皮下接種至每只Balb/c裸鼠體內(nèi)，待腫瘤體積達(dá)到約80 mm3時(shí)，將小鼠隨機(jī)分為五組，分別靜脈注射游離IR808、HSA-IR808和Nb-HSA-IR808探針（400 μM IR808當(dāng)量劑量，100μL）。注射12小時(shí)后，使用808 nm激光（0.7 W/cm2）照射腫瘤部位10分鐘（圖6a）。治療過程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)腫瘤部位溫度，始終維持在42℃以下以避免潛在的光熱效應(yīng)（溫度超過42℃通常會(huì)造成不可逆組織損傷）。如圖6b所示，PBS組和游離IR808組在激光照射下均未顯示腫瘤抑制效果；未接受光照的Nb-HSA-IR808組與PBS組及游離IR808組腫瘤生長(zhǎng)曲線相似，證實(shí)探針本身無抑瘤作用。而Nb-HSA-IR808聯(lián)合激光照射組展現(xiàn)出治療效果——單次靜脈注射后僅需10分鐘近紅外光照射（0.7 W/cm2），14天內(nèi)腫瘤體積較對(duì)照組縮小82%。值得注意的是，非靶向的HSA-IR808組僅表現(xiàn)中等抑瘤效果，凸顯了納米抗體靶向?qū)Ο熜У奶嵘饔?。離體腫瘤照片（圖6c）顯示Nb-HSA-IR808+激光組的腫瘤體積最小，平均重量?jī)H為PBS+激光組的22%（圖6d）。該組小鼠14天存活率保持100%（圖6e），且所有組別小鼠體重均無顯著變化（圖6f），證實(shí)探針系統(tǒng)毒性極低。這些結(jié)果證明：白蛋白增強(qiáng)的單線態(tài)氧生成與納米抗體介導(dǎo)的腫瘤靶向具有協(xié)同增效作用，使Nb-HSA-IR808能以更低輻射劑量（420 J/cm2，遠(yuǎn)低于文獻(xiàn)報(bào)道的600 J/cm2以上）實(shí)現(xiàn)優(yōu)異療效，展現(xiàn)出顯著的臨床轉(zhuǎn)化潛力。

研究者對(duì)各組小鼠腫瘤組織進(jìn)行了病理學(xué)分析。H&E染色和免疫熒光結(jié)果顯示（圖6g），Nb-HSA-IR808聯(lián)合激光照射組的腫瘤切片呈現(xiàn)壞死區(qū)域和強(qiáng)烈的細(xì)胞凋亡信號(hào)，證實(shí)該探針通過光動(dòng)力效應(yīng)有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。為評(píng)估Nb-HSA-IR808的腎毒性風(fēng)險(xiǎn)，研究者檢測(cè)了注射前后小鼠血清尿素和肌酐水平。結(jié)果顯示：Nb-HSA-IR808組與PBS組在注射后72小時(shí)內(nèi)各項(xiàng)指標(biāo)均保持正常范圍（尿素：3.2-13.2 mmol/L；肌酐：11-28 μmol/L），證實(shí)該探針不會(huì)引發(fā)可檢測(cè)的腎損傷。綜上所述，Nb-HSA-IR808探針?biāo)薪M分（納米抗體、白蛋白、IR808）均具有臨床使用基礎(chǔ)，使其成為兼具精準(zhǔn)靶向能力、高效光動(dòng)力活性和優(yōu)良生物安全性的診療一體化平臺(tái)。

參考文獻(xiàn)

Yang, Y.; Zhang, Y.; Zhou, S.; Fang, X.; Zhang, X.; Wei, W.; Huang, G.; Wu, C., Self-Assembled Nanobody-Albumin Platform with Dye Encapsulation for NIR-II Imaging-Guided Photodynamic Therapy. ACS Applied Materials & Interfaces 2025,17 (31), 44249-44262.

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