產(chǎn)品概述

本產(chǎn)品為艾美捷Bethyl Laboratories推出用于定量檢測小鼠血清及血漿中免疫球蛋白G（IgG）濃度的夾心法ELISA試劑盒（貨號：E99-131）。試劑盒采用預(yù)包被96孔板、生物素化檢測抗體及鏈霉親和素-HRP（SA-HRP）顯色系統(tǒng)，檢測范圍為0.69 – 500 ng/ml，適用于小鼠IgG的精確定量分析。該試劑盒在小鼠免疫學(xué)、抗體藥代動力學(xué)、疫苗效價(jià)評估及自身免疫疾病模型研究中具有廣泛應(yīng)用價(jià)值。

核心參數(shù)

參數(shù) 詳細(xì)信息

靶標(biāo) 小鼠IgG（Mouse IgG）

反應(yīng)種屬 小鼠

應(yīng)用 ELISA

檢測范圍 0.69 – 500 ng/ml

樣本類型 血清、血漿

檢測方法 生物素化-鏈霉親和素-HRP

檢測類型 夾心法ELISA

保存條件 2 - 8 °C

有效期 收貨后6個(gè)月

試劑盒組分

組分 規(guī)格 數(shù)量

小鼠IgG預(yù)包被96孔板 96孔/板 1塊

小鼠IgG標(biāo)準(zhǔn)品 500 ng/瓶 2瓶

小鼠IgG檢測抗體 12 ml 1瓶

10X 稀釋緩沖液B 25 ml 1瓶

HRP溶液A 12 ml 1瓶

TMB底物液 12 ml 1瓶

終止液 12 ml 1瓶

20X 洗滌緩沖液 50 ml 1瓶

封板膜 — 6張

檢測原理

本試劑盒采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（Sandwich ELISA）：

1. 包被：96孔板已預(yù)包被抗小鼠IgG捕獲抗體。

2. 加樣：將標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣本加入孔中，樣本中的小鼠IgG與捕獲抗體結(jié)合。

3. 檢測：加入生物素化的小鼠IgG檢測抗體，形成“捕獲抗體-IgG-檢測抗體"夾心復(fù)合物。

4. 酶聯(lián)：加入鏈霉親和素標(biāo)記的辣根過氧化物酶（HRP Solution A），與檢測抗體上的生物素特異性結(jié)合。

5. 顯色：加入TMB底物液，HRP催化底物產(chǎn)生藍(lán)色產(chǎn)物；加入終止液后顏色變?yōu)辄S色。

6. 讀數(shù)：在450 nm波長處測定吸光度（OD值）。樣本中的IgG濃度與OD值呈正比，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得出。

操作流程要點(diǎn)

樣本準(zhǔn)備

血清/血漿：按常規(guī)方法采集，避免溶血和反復(fù)凍融。建議適當(dāng)稀釋后檢測（具體稀釋倍數(shù)需預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，一般血清樣本中IgG含量較高，需稀釋數(shù)萬倍）。

使用10X稀釋緩沖液B配制1X工作液，用于標(biāo)準(zhǔn)品和樣本的稀釋。稀釋緩沖液B含有蛋白穩(wěn)定劑和防腐劑，可有效維持抗體在稀釋狀態(tài)下的穩(wěn)定性。

洗滌液配制

將50 ml 20X洗滌緩沖液用去離子水或蒸餾水稀釋至1000 ml（即1:20稀釋），混勻備用。洗滌液中含有表面活性劑，可有效降低非特異性吸附。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

標(biāo)準(zhǔn)品每瓶含500 ng小鼠IgG。加入適量1X稀釋緩沖液復(fù)溶，制備最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品（500 ng/ml）。

進(jìn)行倍比稀釋，建議制備至少7-8個(gè)標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)（如500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.8125、3.90625、1.953125、0.9765625、0.69 ng/ml）。設(shè)置零孔（稀釋緩沖液空白）作為背景對照。

檢測步驟（簡述）

1. 將標(biāo)準(zhǔn)品和稀釋后的樣本加入預(yù)包被板孔中，每孔100 µl，覆蓋封板膜，在室溫或37°C孵育1-2小時(shí)（具體時(shí)間和溫度請參考試劑盒內(nèi)說明書）。

2. 棄去孔內(nèi)液體，每孔加入300 µl 1X洗滌液，洗板3-5次。每次洗滌后應(yīng)充分拍干孔內(nèi)殘留液體。

3. 加入檢測抗體（已稀釋至工作濃度），每孔100 µl，孵育30-60分鐘。

4. 洗板3-5次。

5. 加入HRP溶液A（已稀釋），每孔100 µl，孵育30分鐘。

6. 洗板3-5次。

7. 加入TMB底物液，每孔100 µl，避光孵育10-20分鐘，直至最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔顯色達(dá)到深藍(lán)色、背景空對照孔無明顯藍(lán)色。

8. 加入終止液，每孔100 µl，輕拍混勻，藍(lán)色立即轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色。

9. 在30分鐘內(nèi)，于450 nm波長處讀取OD值。若使用酶標(biāo)儀的雙波長模式（450 nm減去570 nm或630 nm背景波長），可減少板底瑕疵干擾。

結(jié)果計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的OD值（或經(jīng)四參數(shù)擬合后的值）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

將待測樣本的OD值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計(jì)算出樣本中IgG的濃度，再乘以稀釋倍數(shù)即得原始樣本濃度。

使用注意事項(xiàng)

1. 樣本稀釋：正常小鼠血清中IgG濃度約為2-10 mg/ml，遠(yuǎn)超試劑盒檢測上限（500 ng/ml）。建議先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳稀釋倍數(shù)（通常需稀釋1:10,000至1:50,000倍）。血漿樣本同樣需高倍稀釋。建議使用試劑盒提供的稀釋緩沖液進(jìn)行梯度稀釋。

2. 避免交叉污染：使用一次性吸頭，標(biāo)準(zhǔn)品和樣本按順序加樣。洗板時(shí)確保每次洗滌液加滿孔（300 µl）并充分吸干，不可出現(xiàn)干孔現(xiàn)象，否則會導(dǎo)致背景增高或孔間差異。

3. 顯色控制：TMB顯色時(shí)間需根據(jù)室溫及酶活性適當(dāng)調(diào)整。室溫較低時(shí)顯色較慢，可適當(dāng)延長至20-30分鐘；室溫較高時(shí)顯色迅速，需控制時(shí)間，避免最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品孔出現(xiàn)“鉤狀效應(yīng)"或顏色過深導(dǎo)致酶標(biāo)儀讀數(shù)溢出。

4. 檢測波長：終止后的反應(yīng)產(chǎn)物在450 nm處讀取OD值。若使用雙波長校正（450 nm減去570 nm或630 nm），可減少因板底瑕疵引起的誤差。

5. 有效期：試劑盒自收貨之日起2-8°C保存，有效期6個(gè)月。不同批次試劑組分不可混用，以確保批間一致性。

6. 標(biāo)準(zhǔn)品使用：標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶后建議按單次使用量分裝保存于-20°C或-80°C，避免反復(fù)凍融導(dǎo)致蛋白降解。凍融次數(shù)不超過2次。

7. 防腐劑兼容性：部分樣本（如含疊d化鈉的保存血漿）可能影響HRP活性，需在實(shí)驗(yàn)前通過透析或稀釋降低疊氮化物干擾。