Nucleolin（核仁素）是一種主要的核仁磷酸蛋白，參與前體 rRNA 轉(zhuǎn)錄、核糖體合成與成熟，并能結(jié)合組蛋白 H1 誘導染色質(zhì)凝縮，同時在轉(zhuǎn)錄延伸中發(fā)揮作用。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗核仁素（NCL）抗體親和純化抗體（貨號：A300-711A） 經(jīng)抗原親和純化，特異性識別 人 Nucleolin 蛋白 C 端區(qū)域（第 550–710 位氨基酸），適用于免疫組織化學（IHC）、免疫組織化學-免疫熒光（IHC?IF）、免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB），并交叉識別人和小鼠 Nucleolin。本文基于詳細產(chǎn)品規(guī)格，從基本特性、免疫原設(shè)計、各應(yīng)用優(yōu)化流程、功能背景及常見問題排查等方面提供系統(tǒng)性技術(shù)參考。

一、產(chǎn)品基本規(guī)格與儲存信息

參數(shù)| 內(nèi)容

靶標| Nucleolin（NCL，C23）

反應(yīng)性| 小鼠、人類

應(yīng)用| IHC、IHC?IF、IP、WB

宿主/克隆性 | 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原| 第660位殘基至C末端之間（具體表位第550–710位）

亞型| IgG

標記物| 未標記

純度| 抗原親和純化

抗原種屬|(zhì) 人類

濃度| 200 µg/ml

保存條件| 2?–?8?°C

有效期| 自收貨之日起 1 年

緩沖液| Tris-緩沖鹽水，含 0.1% BSA 及 0.09% 疊d化鈉

儲存與操作提示：  

抗體須始終保存于 2–8?°C，嚴禁冷凍，冷凍會導致蛋白聚集和效價下降。  

緩沖液含 0.1% BSA 作為穩(wěn)定蛋白，有助于稀釋后抗體的短期穩(wěn)定性；疊d化鈉為防腐劑，可能抑制 HRP 活性，若用于活細胞成像需去除。  

抗體濃度為 200?µg/ml，使用時應(yīng)按推薦稀釋比例計算用量。  

濃度采用比爾定律標定（A280?=?1.4 對應(yīng) 1?mg/mL IgG）。

二、推薦應(yīng)用與實驗條件

免疫印跡（Western Blot, WB）

推薦稀釋范圍：1:2,000 – 1:10,000  

封閉液與抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 過夜  

二抗推薦：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

檢測方式：增強型化學發(fā)光（ECL）

WB 優(yōu)化流程

1. 樣本制備：  

陽性對照：HeLa、HEK293、NIH/3T3 或小鼠組織裂解液（Nucleolin 在增殖細胞中高表達）。  

裂解液：RIPA 或 SDS 上樣緩沖液。  

上樣量：20–30?μg 總蛋白（Nucleolin 豐度較高，過度上樣可能導致多條帶）。

2. 電泳：使用 8–10% SDS?PAGE（Nucleolin 分子量約 100–110?kDa，因其磷酸化形式可能遷移至 110?kDa 以上）。  

3. 轉(zhuǎn)?。篜VDF 膜，250?mA 恒流 90 分鐘。  

4. 封閉：5% 脫脂牛奶 / TBST，室溫 1 小時。  

5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:2,000–1:10,000 稀釋（s次建議 1:5,000）。  

6. 洗滌：TBST 洗滌 3?×?10 分鐘。  

7. 二抗孵育：HRP?山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室溫 1 小時。  

8. ECL 檢測。

> 預(yù)期結(jié)果：應(yīng)在約 100–110?kDa 處檢測到一條主帶，有時可見較弱的降解片段（約 70?kDa 或 50?kDa）。若出現(xiàn)多條高背景帶，可提高稀釋度至 1:10,000。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

用量：6?μg 抗體 / mg 總蛋白裂解液  

裂解液要求：非變性裂解緩沖液（50?mM Tris pH 7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40，不含 SDS，添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。

IP 詳細步驟

1. 細胞裂解：收集 1–2 個 10?cm 皿細胞（約 5–10?×?10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分鐘，離心取上清。  

2. 蛋白定量：BCA 法。  

3. 預(yù)清除（可選）：加入 20?μL Protein?A 磁珠，4?°C 旋轉(zhuǎn) 1 小時。  

4. 抗體結(jié)合：取 1?mg 總蛋白，加入 6?μg A300-711A 抗體，4?°C 旋轉(zhuǎn)孵育過夜。  

5. 捕獲復(fù)合物：加入 30?μL Protein?A 磁珠，繼續(xù)孵育 2 小時。  

6. 洗滌：用 IP 裂解液洗滌 4–5 次。  

7. 洗脫：加入 30?μL 2× SDS 上樣緩沖液（含 DTT），95?°C 加熱 10 分鐘。  

8. WB 檢測：取上清進行 SDS?PAGE，使用 抗兔 IgG 輕鏈特異性 HRP 二抗 并在封閉液中添加 5% 正常豬血清（S100?020），以避免重鏈干擾。

注意：Nucleolin 分子量約 100?kDa，遠高于抗體重鏈（≈55?kDa），常規(guī)二抗也可使用；但 IP?WB 檢測低豐度互作蛋白時，仍推薦輕鏈特異性二抗以獲得最干凈背景。

免疫組織化學（Immunohistochemistry, IHC）

推薦稀釋范圍：1:100 – 1:2,000（寬范圍，可根據(jù)組織類型優(yōu)化）  

抗原修復(fù)：檸檬酸鈉緩沖液（pH 6.0），高壓或微波熱修復(fù) 10–15 分鐘。  

樣本類型：福爾馬林固定、石蠟包埋（FFPE）的人或小鼠組織切片。  

封閉：5% 正常血清 / PBS 或 3% BSA / PBS，室溫 30 分鐘。  

檢測：HRP/DAB 顯色（IHC）或熒光二抗（IHC?IF）。

IHC 實驗要點

Nucleolin 定位于細胞核仁（明亮點狀）及核質(zhì)，IHC 染色應(yīng)為核仁/核特異性。  

建議使用扁桃體、乳腺癌組織或增殖活躍的組織作為陽性對照。  

稀釋度從 1:500 開始，若信號過強或背景高，提高至 1:2000。

免疫組織化學-免疫熒光（IHC?IF）

推薦稀釋范圍：1:50 – 1:1,000  

同一修復(fù)條件：檸檬酸 pH?6.0 熱修復(fù)。  

二抗：使用熒光標記的抗兔二抗（如 Alexa Fluor 488、568），避免使用與自發(fā)熒光重疊的波長。  

封片：含 DAPI 的抗淬滅封片劑，共聚焦或熒光顯微鏡觀察。

IF 提示：核仁染色應(yīng)呈現(xiàn)典型的 3–5 個明亮點狀區(qū)域（對應(yīng)核仁）。降低抗體濃度（如 1:1000）可減少核質(zhì)彌散背景。

三、該抗體的核心優(yōu)勢

四重應(yīng)用驗證：WB、IP、IHC、IHC?IF 全覆蓋，滿足蛋白表達、互作與組織定位需求。  

C 端特異性表位：避免與 N 端或 RRM 域蛋白交叉，WB 單條帶清晰。  

人/小鼠交叉反應(yīng)：適用于轉(zhuǎn)基因小鼠模型及人類臨床樣本。  

寬稀釋范圍：WB 1:2,000–1:10,000，IHC 1:100–1:2,000，IHC?IF 1:50–1:1,000，充分適應(yīng)不同實驗靈敏度。  

親和純化低背景：IHC 和 IF 背景低，核仁信號突出。  

含 BSA 穩(wěn)定劑：2–8?°C 液態(tài)保存一年，稀釋后短期穩(wěn)定。