GST瓊脂糖親和層析純化融合蛋白實驗技術體系（含可溶性蛋白與包涵體復性后純化）

摘要

谷胱甘肽S-轉移酶（GST）標簽純化是重組蛋白制備中應用廣泛的親和純化技術之一。GST瓊脂糖填料依托固定化還原型谷胱甘肽與GST標簽的特異性親和作用，可實現(xiàn)大腸桿菌、真核表達系統(tǒng)中GST融合蛋白的高效、溫和純化。該技術適配可溶性天然蛋白純化，同時可兼容包涵體復性后蛋白的精制工藝，純化條件溫和、蛋白活性保留度高，且支持柱上酶切去標簽、GST Pull-down蛋白互作驗證等拓展實驗。本文系統(tǒng)闡述GST瓊脂糖純化技術原理、實驗材料、標準化操作流程、包涵體樣品專屬純化方案、常見問題排查及技術應用場景，為重組蛋白制備、蛋白互作研究、功能活性檢測（MST/nanoDSF）提供標準化技術支撐。

1 引言

在重組蛋白表達研究中，GST標簽因溶解度高、穩(wěn)定性強、適配性廣等優(yōu)勢，被廣泛用于目的蛋白的可溶性提升與親和純化。相較于His標簽，GST標簽可顯著提高難溶蛋白、膜蛋白的可溶性，且純化全程為非變性條件，大程度保留蛋白天然構象與生物活性。

GST瓊脂糖是該技術的核心介質，以交聯(lián)瓊脂糖為基質，共價偶聯(lián)還原型L-谷胱甘肽，可特異性結合GST融合蛋白。常規(guī)實驗體系可分為可溶性菌體蛋白純化與包涵體復性后蛋白純化兩類，其中包涵體樣品因前期經過變性處理，需嚴格匹配專屬操作規(guī)范，是提升難折疊蛋白純化回收率的關鍵。本文整合主流商用填料（Cytiva 4FF/HP系列）標準化工藝，形成一套可直接落地的完整實驗技術方案。

2 實驗原理

GST標簽可與還原型谷胱甘肽（GSH）發(fā)生特異性可逆結合，該反應具有親和力高、特異性強、結合條件溫和的特點。GST瓊脂糖填料通過長間隔臂將GSH固定于交聯(lián)瓊脂糖基質表面，有效降低空間位阻，保證GST融合蛋白高效結合。

實驗核心流程為：樣品上清與填料孵育結合→雜蛋白洗脫去除→游離谷胱甘肽競爭性洗脫目的蛋白。洗脫條件為中性溫和體系，無強變性劑、無酸堿，可完整保留蛋白二級結構與生物活性。同時，結合在填料上的融合蛋白可直接進行柱上蛋白酶切（PreScission/凝血酶），實現(xiàn)標簽與目的蛋白分離，簡化后續(xù)純化步驟。

值得注意的是，強變性劑（尿素、鹽酸胍）會破壞GST標簽空間構象，導致其喪失與GSH的結合能力，因此包涵體樣品必須完成復性、去除變性劑后，方可進行GST瓊脂糖純化。

3 實驗材料與儀器

3.1 核心實驗試劑與介質

核心介質：GST瓊脂糖親和填料（主流型號：Cytiva Glutathione Sepharose 4FF/HP，國產等效4FF填料），出廠為50%漿液（含20%乙醇保護液）。

緩沖體系（標準配方，適配可溶性蛋白與復性后包涵體蛋白）：

• 結合/洗滌緩沖液（PBS-T）：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、0.1% CHAPS、pH 7.4；添加低濃度CHAPS可抑制蛋白非特異性吸附，適配膜蛋白、易聚集復性蛋白，不干擾GST與GSH特異性結合。

• 洗脫緩沖液：20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、10 mM 還原型谷胱甘肽、pH 8.0；中性溫和體系，避免蛋白變性失活。

• 填料再生液：0.1 M NaOH溶液，用于去除頑固雜蛋白與核酸殘留。

• 保存液：20%乙醇-PBS溶液，無菌無酶，適配填料長期儲存。

輔助試劑：PMSF蛋白酶抑制劑、DTT、Bradford蛋白定量試劑、TEV/PreScission蛋白酶（酶切去標簽用）。

3.2 實驗儀器

高速冷凍離心機、恒溫翻轉搖床、重力層析柱、AKTA純化系統(tǒng)（可選）、紫外分光光度計、電泳儀（SDS-PAGE）、超純水儀。

4 標準化實驗操作流程

4.1 填料預處理

GST瓊脂糖填料出廠含20%乙醇保護液，使用前需置換，避免影響蛋白結合：

1. 取適量50%填料漿液，4℃、500 g低速離心3 min，棄上層保護液；

2. 加入3倍柱體積結合洗滌液，輕柔吹打重懸，離心棄上清，重復洗滌2–3次，完成填料平衡；

3. 最后用結合洗滌液重懸填料，備用。

4.2 樣品制備（兩種樣品體系）

4.2.1 可溶性菌體樣品

誘導表達后的菌體經超聲裂解、低溫高速離心，取澄清上清，補加PMSF抑制劑，避免蛋白降解，置于4℃備用。

4.2.2 包涵體復性后樣品（專屬關鍵步驟）

包涵體經洗滌、8M尿素/6M鹽酸胍變性溶解后，通過透析或梯度稀釋完成蛋白復性；復性完成后充分透析去除全部變性劑，12000 g離心10 min去除聚集沉淀，取澄清上清備用，嚴禁含殘留變性劑的樣品上柱。

4.3 蛋白結合反應

1. 將預處理后的GST瓊脂糖填料與澄清樣品上清按比例混合；

2. 4℃低溫翻轉孵育30–60 min，保證GST標簽與填料充分結合；

3. 孵育結束后500 g離心3 min，棄上清，收集結合蛋白的填料沉淀。

4.4 雜蛋白洗滌除雜

1. 加入3–5倍柱體積的PBS-T洗滌液，輕柔重懸填料，4℃靜置5 min；

2. 低速離心棄上清，重復洗滌3–4次，大程度去除非特異性吸附的雜蛋白、核酸與脂質雜質；

3. 對于純度要求較高的樣品，可適當增加洗滌次數(shù)，降低背景雜帶。

4.5 目的蛋白洗脫

1. 向填料中加入適量洗脫緩沖液，輕柔重懸，室溫靜置孵育10 min，利用游離GSH競爭性置換結合位點的GST融合蛋白；

2. 低速離心收集上清，即為純化后的目的蛋白；

3. 重復洗脫2–3次，合并洗脫液，提升蛋白回收率；

4. 洗脫完成后通過Bradford法定量、SDS-PAGE電泳檢測純化效果。

4.6 柱上酶切去標簽（可選進階操作）

若需去除GST標簽獲取天然目的蛋白，可在填料結合蛋白、洗滌除雜后，加入適配的蛋白酶（PreScission蛋白酶），4℃搖床酶切過夜，次日收集上清即為無標簽目的蛋白，操作簡便且蛋白損耗低。

4.7 填料再生與保存

1. 使用后的填料加入0.1 M NaOH浸泡5–10 min，去除殘留變性蛋白與雜質；

2. 超純水充分洗滌中和，再用PBS平衡；

3. 最終置于20%乙醇-PBS保存液中，4℃密封避光儲存，可重復使用10–25次（依填料型號而定）。

5 關鍵技術要點與注意事項

5.1 包涵體樣品專屬要點

包涵體蛋白變性后GST標簽空間結構被破壞，喪失結合能力，因此必須復性、去除全部尿素/鹽酸胍后方可純化；復性緩沖液中低濃度CHAPS（0.05%–0.1%）可有效抑制蛋白聚集，提升純化回收率。

5.2 緩沖體系禁忌

純化體系中禁止高濃度游離谷胱甘肽、強還原劑，會競爭性搶占填料結合位點，大幅降低蛋白結合效率；避免高濃度去垢劑，CHAPS濃度需嚴格控制≤0.1%。

5.3 蛋白活性保護

全程4℃低溫操作，可有效防止目的蛋白降解、聚集；溫和洗脫體系無需后續(xù)復性，純化產物可直接用于MST親和力檢測、nanoDSF穩(wěn)定性分析、酶活實驗等功能檢測。

6 常見問題與解決方案

7 技術應用場景

1.重組蛋白制備：大腸桿菌原核表達可溶性GST融合蛋白、包涵體復性后蛋白的精制純化，產物活性高、純度達標，可滿足功能實驗、結構解析需求。

2.蛋白互作研究：GST Pull-down體外互作實驗，驗證蛋白-蛋白、蛋白-小分子相互作用，適配后續(xù)MST、SPR親和力驗證實驗。

3. 膜蛋白純化：適配含低濃度CHAPS的膜蛋白體系，溫和純化保留膜蛋白天然構象與結合活性。

4.標簽去除與天然蛋白制備：柱上酶切高效去除GST標簽，獲得無標簽活性目的蛋白，適用于酶活檢測、細胞功能實驗。

8 結語

GST瓊脂糖親和純化技術憑借特異性強、條件溫和、蛋白活性保留度高、拓展性強等優(yōu)勢，成為重組蛋白純化的核心技術。相較于其他純化體系，該技術可適配常規(guī)可溶性蛋白與包涵體復性后蛋白的純化需求，通過標準化緩沖體系與操作流程，可有效解決蛋白聚集、純度低、回收率差等問題。純化所得蛋白可直接對接后續(xù)分子互作、穩(wěn)定性檢測、功能驗證等實驗，是分子生物學、結構生物學、藥理學研究中的基礎實驗技術。