作者：Repligen瑞普利金

研究背景與目的

1.AAV在基因治療中的重要性：腺相關(guān)病毒（AAV）因無致病性、嗜性廣、免疫原性低及能實現(xiàn)高效長效基因轉(zhuǎn)移，成為基因治療的關(guān)鍵載體。AAV為無包膜單鏈DNA病毒，衣殼直徑約25nm，其生產(chǎn)需多步復(fù)雜流程，其中病毒顆粒純化環(huán)節(jié)占總生產(chǎn)成本比例高，常依賴切向流過濾（TFF）進行濃縮和緩沖液交換。

2. 研究目的：對比Repligen公司Spectrum® 100 kD mPES（改性聚醚砜）中空纖維濾膜與PS（聚苯乙烯）中空纖維濾膜的性能，驗證可靠且具有工藝可預(yù)測性的濾膜對加速基因治療從研發(fā)到商業(yè)化進程的作用。兩類濾膜均為0.5mm內(nèi)徑、100kD分子量截留值（MWCO），評估維度包括標準水通量（NWP）、工藝臨界通量及代表性超濾/換液（UF/DF）工藝表現(xiàn)。

02材料與方法

01標準水通量（NWP）測定

1.實驗系統(tǒng)與參數(shù)：實驗采用Repligen KrosFlo KR2i RPM TFF系統(tǒng)；進口流速對應(yīng)的剪切力為5500s?1，跨膜壓（TMP）10psi。

2.中空纖維沖洗流程：Repligen mPES中空纖維：用去離子水（dH?O）沖洗，使2mL/cm2的dH?O 透過透過端。PS中空纖維：先使用20%異丙醇（IPA）水溶液潤洗，再用 dH?O 沖洗，保證透過端體積至少為2mL/cm2；沖洗剪切速率均為5500s?1、TMP 10psi。

3.標準水通量 (NWP) 計算：沖洗后維持5500s?1剪切速率、10psi TMP，每30秒記錄一次通量，實驗持續(xù)20分鐘；結(jié)合水溫、壓力和通量數(shù)據(jù)，采用20℃溫度校正因子（TCF）計算NWP。

02Flux vs TMP研究

1. 實驗系統(tǒng)與樣品：同上述TFF系統(tǒng)，以1e+12 vp/mL的AAV9病毒溶液為樣品，進料流速對應(yīng)剪切速率8000s?1，TMP設(shè)定點為3、5、10、20、30psi，每組實驗重復(fù)3次。

2. 操作流程：

- 膜沖洗：同NWP測定的沖洗步驟。

- 通量 (Flux) VS 跨膜壓（TMP）研究：上樣后首先用ABV維持目標TMP，在每個TMP設(shè)定點收集透過液30分鐘，通過稱量透過端質(zhì)量，結(jié)合實驗時間和膜表面積換算成通量（LMH，升/平方米·小時）；完成TMP為3psi測定后，依次升高TMP至5、10、20、30psi重復(fù)操作，且每次升高TMP前將透過端液回流至進樣容器并重新稱量透過端流速，計算通量。

03UF/DF（濃縮/換液/濃縮，C/D/C）工藝實驗

1. 實驗參數(shù)設(shè)定：基于臨界通量實驗確定TMP，兩類濾膜均采用8000s?1剪切速率；為保證一致性，統(tǒng)一設(shè)定目標TMP為10psi；濃縮因子CF1=2倍、CF2=10倍，兩次濃縮間用3倍料液體積（DVs）的1×磷酸鹽緩沖液（PBS）進行換液。

2. 樣品體積縮小模型實驗：因兩種材質(zhì)中空纖維面積不同，線性縮放AAV9起始液和PBS換液緩沖液體積，確保兩組實驗的體積通量（VT）一致；采用RPM軟件自動C/D/C模式運行，實驗持續(xù)至達到透過端天平設(shè)定值。

3. 樣品分析：用CTech™ SoloVPE®測定進料和最終濃縮液的病毒滴度，通過系統(tǒng)天平稱量計算物料平衡

03研究結(jié)果與討論

01標準水通量（NWP）

1. 數(shù)據(jù)對比：Repligen 100 kD mPES濾膜平均NWP為76±5 LMH/psi，其他PS濾膜為24±4 LMH/psi，mPES濾膜NWP約為PS濾膜的3倍（見圖1）。

2.意義：NWP可作為膜性能基準幫助判斷膜的透過性——由于多數(shù)中空纖維UF/DF應(yīng)用為水基體系，NWP能反映用戶應(yīng)用中的最大允許通量（工藝通量通常低于水通量）。結(jié)果表明，相同條件下mPES濾膜可實現(xiàn)更快的工藝通量，從生產(chǎn)角度可縮短處理時間、減少所需膜表面積，并降低壓力、設(shè)備占地面積等工藝需求。

圖1：100kD瑞普利金mPES與其他PS中空纖維膜的平均NWP值

02TMP VS Flux

1.通量-壓力關(guān)系：兩類濾膜均呈現(xiàn)壓力依賴區(qū)和壓力獨立區(qū)（見圖2）：

Repligen mPES濾膜：TMP≤10psi為壓力依賴區(qū)，5-10psi為過渡階段；TMP>10psi時通量增幅?。?0psi時約220LMH，30psi時約280LMH）；在1e+12 vp/mL AAV9、8000s?1剪切速率下，10psi TMP時達到工藝通量（約220LMH）。

其他PS濾膜：工藝通量非線性增長，壓力獨立區(qū)上限達20psi；TMP從10psi升至20psi時通量增長40%，從20psi升至30psi時僅增長8%。

2.通量差異與跨膜壓: mPES濾膜在10psi TMP即可實現(xiàn)約200LMH的通量，而PS濾膜需20psi，即mPES濾膜可在低2-3倍的操作壓力下達到目標通量；兩類濾膜平均工藝通量差異為44%，mPES濾膜表現(xiàn)更優(yōu)。

3臨界通量區(qū)間：mPES濾膜臨界通量區(qū)間為5-10psi，PS濾膜為10-15psi。

圖2：采用濃度為1×1012病毒顆粒/毫升的AAV9，在不同跨膜壓下， mPES與PS 材質(zhì)100kD中空纖維膜進行評估的臨界通量圖

03

UF/DF（C/D/C）工藝表現(xiàn)

1.通量與處理時間：在相同的載量和濃縮倍數(shù)換液倍數(shù)條件下，Repligen mPES濾膜對AAV9溶液的平均工藝通量為143±7 LMH，其他PS濾膜為84±16 LMH；因mPES濾膜通量更高，其工藝完成時間比PS濾膜縮短約60%（見圖3）。

2.通量穩(wěn)定性：mPES濾膜在整個工藝過程中通量衰減少，始終維持在約140LMH；PS濾膜通量從初始120LMH降至工藝結(jié)束時的60LMH。

3.回收率：mPES濾膜工藝的AAV9回收率>95%，PS濾膜僅約65%；兩類工藝的透過液中中均未檢測到產(chǎn)物，推測PS濾膜的產(chǎn)物損失源于非特異性結(jié)合或膜吸附。

圖3：UF/DF（濃縮/換液/濃縮（C/D/C））工藝實驗

04研究結(jié)論

1.性能優(yōu)勢：在相同實驗條件下，Repligen 100 kD mPES中空纖維濾膜的NWP（約3倍）、臨界通量（低壓力下更高通量）及UF/DF工藝通量（1.4-2倍）均顯著優(yōu)于其他PS濾膜，且通量穩(wěn)定性更強（衰減少）。

2.工藝效率與成本：mPES濾膜可將AAV9溶液從1e12 vp/mL濃縮至1e13 vp/mL的時間縮短至約75分鐘（PS濾膜需120分鐘以上），同時產(chǎn)物回收率提升30個百分點（>95% vs 65%），能有效降低基因治療中AAV生產(chǎn)的時間成本和產(chǎn)物損失，為基因治療商業(yè)化提供更高效的純化解決方案。