小鼠腦周細胞永生化細胞是通過SV40大T抗原基因轉染原代小鼠腦微血管周細胞獲得的?無限增殖、保留關鍵表型的體外模型?，用于血腦屏障、神經血管單元及腦疾病機制研究。??

一、培養(yǎng)基與試劑細節(jié)

1、血清必須優(yōu)質且批次固定

周細胞對 FBS 非常敏感，批次不同會導致形態(tài)變差、增殖變慢。

建議一次訂購同一批次血清，測試后再大量使用。

2、不要隨意更換基礎培養(yǎng)基

常用：高糖 DMEM/DMEM/F12

一旦確定，不要頻繁更換，否則細胞容易應激。

3、雙抗?jié)舛炔灰^高

常規(guī) 1% 即可，過高會抑制周細胞生長。

4、培養(yǎng)基避免反復凍融

配好的培養(yǎng)基 4℃保存，1 周內用完。

二、細胞復蘇細節(jié)

1、復蘇速度一定要快

37℃水浴快速融化，1 分鐘內完成，減少 DMSO 毒性。

2、復蘇當天不要離心過猛

1000 rpm，3 min 足夠，轉速太高細胞易死亡。

3、復蘇后 24h 內必須換液

去除 DMSO 和死細胞碎片，否則極易污染、狀態(tài)差。

三、傳代核心細節(jié)（最關鍵）

傳代時機：80–90% 匯合度

太?。涸鲋陈?/span>

太密：接觸抑制，形態(tài)變扁，表型丟失

胰酶消化時間嚴格控制

永生化周細胞貼壁很牢，但不能過度消化。

顯微鏡下看到細胞開始變圓、間隙變大就立即終止。

一般1–2 min，超過 3 min 容易損傷細胞膜。

吹打力度輕柔

周細胞敏感，暴力吹打會導致細胞碎片多、狀態(tài)差。

用移液管輕輕吹打 10 次左右至單細胞懸液即可。

傳代比例建議 1:2~1:3

不要 1:5 以上，否則細胞生長慢、形態(tài)差。

四、貼壁與包被細節(jié)

培養(yǎng)瓶/皿建議包被

0.1% 明膠或多聚賴氨酸包被 1–2 小時

包被后細胞貼壁更牢、形態(tài)更標準（長梭形）

傳代后 6 小時內不要移動培養(yǎng)瓶

讓細胞充分貼壁，否則容易漂浮死亡。

五、污染防控細節(jié)

1、支原體必須定期檢測

周細胞一旦支原體污染，形態(tài)立刻變差、增殖變慢。

建議每 2 周檢測一次。

2、操作環(huán)境嚴格無菌

腦周細胞容易被成纖維細胞、內皮細胞污染。

操作前酒精充分消毒，避免口對著超凈臺說話。

六、細胞狀態(tài)與表型維護細節(jié)

1、嚴格控制代次

建議30 代以內使用，代數過高表型會漂移。

標志物（α-SMA、NG2、PDGFRβ）會減弱。

2、避免反復饑餓

不要長時間無血清培養(yǎng)，周細胞容易凋亡。

3、形態(tài)異常立即排查

正常：長梭形、放射狀排列

異常：變圓、漂浮、胞質顆粒多 → 多為血清、消化、污染問題

七、凍存細節(jié)

凍存細胞必須處于對數生長期

匯合度 70–80% ，活力。

凍存液現配現用

90% FBS + 10% DMSO

DMSO 有毒，不可提前配好久放。

梯度降溫

程序降溫盒 - 80℃過夜，次日液氮保存。

直接 - 80℃不降溫會大幅降低存活率。

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