一、甲基化研究的“普查時(shí)代”

在全基因組范圍內(nèi)繪制甲基化圖譜，已成為表觀遺傳學(xué)研究的常規(guī)操作。無(wú)論是Illumina的甲基化芯片，還是全基因組重亞硫酸鹽測(cè)序（WGBS），都讓研究人員能夠在單次實(shí)驗(yàn)中獲取成千上萬(wàn)個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)信息。這些高通量技術(shù)為發(fā)現(xiàn)新的甲基化標(biāo)志物、揭示疾病相關(guān)的表觀遺傳變化提供了篩選工具。

然而，高通量篩選的“廣度”往往伴隨著“精度”的妥協(xié)。甲基化芯片和甲基化測(cè)序得出的數(shù)據(jù)，本質(zhì)上是一種統(tǒng)計(jì)估算——它們基于大量DNA片段的信號(hào)平均值或測(cè)序 reads 的匯總結(jié)果來(lái)推斷每個(gè)位點(diǎn)的甲基化水平。

二、甲基化數(shù)據(jù)的不足

甲基化芯片的工作原理是基于探針與目標(biāo)DNA雜交后的熒光信號(hào)強(qiáng)度來(lái)推算甲基化水平。這種估算方式不可避免地受到多種技術(shù)因素的影響：首先，探針可靠性參差不齊。其次，技術(shù)變異普遍存在。近年來(lái)多項(xiàng)研究系統(tǒng)評(píng)估發(fā)現(xiàn)探針的重復(fù)測(cè)量一致性存在較大波動(dòng)。同一份DNA樣本在重復(fù)測(cè)量中可能得到不一致的β值。

測(cè)序數(shù)據(jù)同樣面臨類似困境。 重亞硫酸鹽測(cè)序雖然單堿基分辨率高，但其覆蓋深度不均、轉(zhuǎn)化效率波動(dòng)、比對(duì)困難等問(wèn)題，同樣使得最終輸出的甲基化水平帶有統(tǒng)計(jì)估算的成分。不同平臺(tái)、不同批次的測(cè)序數(shù)據(jù)之間，結(jié)果往往存在顯著差異。

三、為什么關(guān)鍵位點(diǎn)需要驗(yàn)證？

當(dāng)您從高通量篩選中鎖定了一個(gè)或幾個(gè)關(guān)鍵甲基化位點(diǎn)——無(wú)論是作為疾病生物標(biāo)志物、還是作為功能研究的目標(biāo)——您需要的是一個(gè)精準(zhǔn)、可重復(fù)的絕對(duì)定量結(jié)果，而非一個(gè)帶有不確定性的估算值。

這正是驗(yàn)證的價(jià)值所在。正如在轉(zhuǎn)錄組研究中qPCR是驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的“金標(biāo)準(zhǔn)”，在甲基化研究中，數(shù)字PCR正在成為驗(yàn)證芯片和測(cè)序數(shù)據(jù)的理想工具。如果說(shuō)甲基化芯片和測(cè)序是對(duì)全基因組進(jìn)行“普查”，那么數(shù)字PCR就是對(duì)關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行“精準(zhǔn)測(cè)量”——兩者分工不同，但后者才是得出確定性結(jié)論的關(guān)鍵一步。

四、翼和服務(wù)：讓您的甲基化數(shù)據(jù)更可靠

翼和可提供基于數(shù)字PCR（dPCR） 的甲基化驗(yàn)證服務(wù)：

驗(yàn)證芯片/測(cè)序篩選的關(guān)鍵甲基化位點(diǎn)——對(duì)高通量數(shù)據(jù)中的候選位點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)復(fù)測(cè)
獲得甲基化比例的絕對(duì)定量——無(wú)需依賴標(biāo)準(zhǔn)曲線，直接計(jì)算目標(biāo)序列中甲基化分子的比例
提供可重復(fù)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)——數(shù)字PCR的高精度和良好復(fù)現(xiàn)性，為您的結(jié)論提供堅(jiān)實(shí)支撐

從全基因組篩查到關(guān)鍵位點(diǎn)精準(zhǔn)驗(yàn)證，翼和用數(shù)字PCR為您的甲基化研究把好最后一道關(guān)。