人扁桃體動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞的分離和培養(yǎng)是獲取高純度、有活性細(xì)胞的關(guān)鍵步驟，其流程需兼顧無菌操作、細(xì)胞活性保護(hù)及內(nèi)皮細(xì)胞特異性純化，具體方法如下：

一、材料準(zhǔn)備

1、樣本來源：新鮮的人扁桃體組織（通常來自扁桃體切除術(shù)標(biāo)本，需符合倫理規(guī)范并獲得知情同意）。

2、主要試劑：

基礎(chǔ)培養(yǎng)基：DMEM/F12 或 M199 培養(yǎng)基（含 L - 谷氨酰胺）。

添加劑：胎牛血清（FBS，終濃度 10%-20%）、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（ECGF）、肝素（抑制平滑肌細(xì)胞污染）、青霉素 - 鏈霉素（抗菌）。

消化試劑：0.1% 膠原酶 Ⅰ（或 Ⅱ 型）、0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 混合液。

3、其他：PBS（無鈣鎂）、培養(yǎng)皿（或 flask，預(yù)包被明膠以促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞貼壁）、手術(shù)器械（眼科剪、鑷）等。

二、分離步驟

1、組織處理：

扁桃體組織用含雙抗的 PBS 沖洗 3-5 次，去除表面血跡和雜質(zhì)。

用眼科剪將組織剪成 1-2 mm3 的小塊，轉(zhuǎn)入離心管中。

2、血管剝離（關(guān)鍵步驟）：

在解剖顯微鏡下，用精細(xì)鑷子分離組織塊中的小動(dòng)脈（管徑約 0.5-1 mm，呈條索狀、有彈性）。

剝離動(dòng)脈外膜的結(jié)締組織，保留動(dòng)脈中膜和內(nèi)膜（內(nèi)皮細(xì)胞位于內(nèi)膜層）。

3、酶消化：

將剝離的動(dòng)脈段剪碎成更細(xì)小的片段（約 0.5 mm），加入適量膠原酶 Ⅰ 溶液（覆蓋組織），37℃ 水浴消化 30-60 分鐘（期間輕輕震蕩）。

消化結(jié)束后，加入含 FBS 的培養(yǎng)基終止消化，1000 rpm 離心 5 分鐘，棄上清。

沉淀用 PBS 洗滌 1 次，再次離心，收集細(xì)胞。

三、原代培養(yǎng)步驟

1、接種：

將離心后的細(xì)胞重懸于內(nèi)皮細(xì)胞專用培養(yǎng)基（含 10% FBS、ECGF、肝素、雙抗），接種到預(yù)包被明膠（0.1%）的培養(yǎng)皿中。

置于 37℃、5% CO? 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 小時(shí)內(nèi)不換液，讓細(xì)胞貼壁。

2、換液與純化：

培養(yǎng) 24-48 小時(shí)后，更換培養(yǎng)基，去除未貼壁的細(xì)胞和雜質(zhì)。

后續(xù)每 2-3 天換液 1 次，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。若出現(xiàn)成纖維細(xì)胞或平滑肌細(xì)胞污染（形態(tài)為長(zhǎng)梭形，與內(nèi)皮細(xì)胞的多邊形 / 鋪路石樣形態(tài)不同），可通過以下方法純化：

差速貼壁法：內(nèi)皮細(xì)胞貼壁較慢（2-4 小時(shí)），成纖維細(xì)胞貼壁快（30 分鐘內(nèi)），可通過短時(shí)間貼壁轉(zhuǎn)移上清，富集內(nèi)皮細(xì)胞。

選擇性培養(yǎng)基：含肝素的培養(yǎng)基可抑制平滑肌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增殖。

3、傳代培養(yǎng)：

當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到 80%-90% 時(shí)進(jìn)行傳代，用 PBS 洗滌細(xì)胞 2 次。

加入 0.25% 胰蛋白酶 - EDTA 溶液，37℃ 孵育 1-2 分鐘，鏡下觀察到細(xì)胞變圓后，加入含 FBS 的培養(yǎng)基終止消化。

吹打細(xì)胞使其脫落，1000 rpm 離心 5 分鐘，重懸后按 1:2 比例接種到新的培養(yǎng)皿中。

傳代后 24 小時(shí)更換培養(yǎng)基，去除未貼壁細(xì)胞。

四、細(xì)胞鑒定（確保純度）

形態(tài)學(xué)觀察：內(nèi)皮細(xì)胞呈典型的“鋪路石”樣或多邊形，排列緊密，邊界清晰。

免疫熒光染色：檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞特異性標(biāo)志物，如 CD31（血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子）、vWF（血管性血友病因子），陽性率需 ≥90%。

功能驗(yàn)證：體外管腔形成實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證其血管內(nèi)皮細(xì)胞功能。

五、注意事項(xiàng)

無菌操作：全程嚴(yán)格無菌，避免細(xì)菌、真菌污染（尤其組織樣本易攜帶微生物）。

消化時(shí)間：膠原酶消化時(shí)間需控制，過長(zhǎng)會(huì)損傷細(xì)胞，過短則細(xì)胞分離不充分。

純化關(guān)鍵：早期污染的雜細(xì)胞（如平滑肌、成纖維細(xì)胞）會(huì)抑制內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)，需及時(shí)通過換液或差速貼壁去除。

傳代限制：原代內(nèi)皮細(xì)胞通常可傳 3-5 代，傳代過多易發(fā)生表型改變，建議早期凍存?zhèn)溆谩?/span>

通過以上步驟，可獲得高純度、具有活性的人扁桃體動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，為后續(xù)的基礎(chǔ)研究或應(yīng)用實(shí)驗(yàn)提供可靠的細(xì)胞模型。

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