易歐賽生物：免疫熒光染色是鑒定兔肺大動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞的常用方法，核心是通過特異性抗體檢測成纖維細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)，同時(shí)排除雜細(xì)胞標(biāo)志物。以下是詳細(xì)操作步驟：

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

材料與試劑

細(xì)胞：培養(yǎng)至對數(shù)期的兔肺大動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞（建議接種于細(xì)胞爬片上，便于后續(xù)操作）。

試劑：

固定液：4% 多聚甲醛（PFA，現(xiàn)配或 - 20℃保存）。

洗滌液：PBS（含 0.05% Tween-20，即 PBST，現(xiàn)配）。

封閉液：5% 牛血清白蛋白（BSA）或山羊血清（溶于 PBST，過濾除菌）。

一抗：抗 Vimentin 抗體（兔源或鼠源，按說明書稀釋，如 1:200-1:500）；陰性對照抗體；可選：抗 α-SMA、CD31 抗體（排除雜細(xì)胞）。

二抗：熒光標(biāo)記的二抗（如標(biāo)記的山羊抗兔 IgG，或 Cy3 標(biāo)記的山羊抗鼠 IgG，避光保存，1:500 稀釋）。

核染劑：DAPI（1μg/mL，避光，染細(xì)胞核）。

封片劑：抗熒光淬滅封片劑（防止熒光衰減）。

器材：超凈臺(tái)、CO?培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、熒光顯微鏡、濕盒（鋪有濕紗布的培養(yǎng)皿）、移液槍、鑷子、載玻片、蓋玻片等。

二、操作步驟

1、細(xì)胞爬片準(zhǔn)備

提前 1-2 天，將滅菌的細(xì)胞爬片放入 6 孔板或 24 孔板，接種兔肺大動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞，密度約 50%-60%（避免過度融合影響染色），置于 37℃、5% CO?培養(yǎng)箱培養(yǎng)至貼壁生長。

2、固定細(xì)胞

取出培養(yǎng)板，吸棄培養(yǎng)液，用 PBST 輕輕洗滌細(xì)胞爬片 3 次（每次 2 分鐘，洗去殘留培養(yǎng)基）。

加入 4% 多聚甲醛，室溫固定 15-20 分鐘（固定時(shí)間過長可能影響抗原活性）。

吸棄固定液，PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘（洗去殘留甲醛）。

3、通透處理（可選，根據(jù)抗原位置）

若檢測的抗原位于細(xì)胞內(nèi)，需用含 0.1% Triton X-100 的 PBST 室溫通透 10-15 分鐘（增加細(xì)胞膜通透性，便于抗體進(jìn)入）。

PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘。

4、封閉非特異性結(jié)合

吸盡 PBST，在爬片上滴加 5% BSA 封閉液（覆蓋細(xì)胞即可），置于濕盒中，室溫封閉 30-60 分鐘（避免抗體與細(xì)胞表面非特異性位點(diǎn)結(jié)合，減少背景）。

封閉后無需洗滌，直接吸棄封閉液（勿用 PBST 洗，避免沖走封閉蛋白）。

5、一抗孵育

按說明書稀釋一抗（如 Vimentin 抗體 1:300 溶于 5% BSA），滴加于爬片上（確保覆蓋所有細(xì)胞）。

陰性對照組：滴加同型對照 IgG（與一抗來源、濃度一致）。

濕盒密封，4℃孵育過夜（或室溫孵育 2 小時(shí)，4℃孵育可增強(qiáng)特異性結(jié)合）。

6、二抗孵育（避光操作）

取出濕盒，吸棄一抗，PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘（充分洗去未結(jié)合的一抗，降低背景）。

按比例稀釋熒光二抗（如 1:500 溶于 5% BSA），滴加于爬片上，室溫避光孵育 1 小時(shí)（避免熒光淬滅，操作時(shí)可關(guān)燈或用鋁箔包裹培養(yǎng)板）。

7、細(xì)胞核染色（DAPI）

吸棄二抗，PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘。

滴加 DAPI 染液（覆蓋細(xì)胞），室溫避光染色 5-10 分鐘。

PBST 洗滌 3 次，每次 5 分鐘（洗去未結(jié)合的 DAPI，減少核染色背景）。

8、封片與觀察

用鑷子小心取出爬片，細(xì)胞面朝下輕輕貼在滴有抗熒光淬滅封片劑的載玻片上（避免產(chǎn)生氣泡），多余封片劑用濾紙吸去。

熒光顯微鏡下觀察：Vimentin 陽性信號(hào)為綠色或紅色（Cy3），定位于胞質(zhì)；DAPI 染色的細(xì)胞核為藍(lán)色。

拍照記錄：選擇 3-5 個(gè)視野，計(jì)算陽性細(xì)胞比例（≥90% 為純度達(dá)標(biāo)）。

三、關(guān)鍵注意事項(xiàng)

避光操作：熒光二抗和 DAPI 需全程避光，避免熒光淬滅影響信號(hào)。

洗滌充分：每步洗滌需，減少未結(jié)合抗體殘留，降低非特異性染色背景。

抗體稀釋：嚴(yán)格按照說明書稀釋一抗和二抗，濃度過高易導(dǎo)致背景增強(qiáng)，過低則信號(hào)弱。

陰性對照：設(shè)置同型 IgG 對照，排除抗體非特異性結(jié)合的干擾。

細(xì)胞狀態(tài)：確保細(xì)胞爬片生長狀態(tài)良好，避免過度融合或凋亡（凋亡細(xì)胞可能出現(xiàn)非特異性染色）。

通過以上步驟，可特異性檢測兔肺大動(dòng)脈外膜成纖維細(xì)胞的 Vimentin 表達(dá)，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征，準(zhǔn)確鑒定細(xì)胞類型及純度。

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