PK15是貼壁生長的豬腎上皮細(xì)胞，常規(guī)培養(yǎng)操作流程及注意事項(xiàng)整理如下：

一、培養(yǎng)基礎(chǔ)條件

培養(yǎng)基選擇?：常用方案為?DMEM或MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加10%胎牛血清(FBS)+1%雙抗(P/S)?，也有商品化無血清PK15專用培養(yǎng)基可直接使用，無需額外添加成分。

培養(yǎng)環(huán)境?：氣相條件為95%空氣+5% CO?，培養(yǎng)溫度恒定?37℃?，需保持培養(yǎng)箱濕度飽和（約95%濕度）。

二、細(xì)胞復(fù)蘇操作

從液氮中取出凍存管，立即放入37℃水浴快速搖晃，直至凍存液融化（控制在1分鐘內(nèi)）。

將凍存管轉(zhuǎn)移至超凈臺，75%酒精消毒管壁后，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到含10mL預(yù)溫培養(yǎng)基的離心管中，190×g離心5分鐘，棄上清。

用預(yù)溫的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放入培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁狀態(tài)更換培養(yǎng)基。

三、傳代培養(yǎng)操作

PK15細(xì)胞貼壁強(qiáng)度偏高，消化需要充足時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)流程如下：

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%融合度時(shí)即可傳代，吸盡原培養(yǎng)基，用3-4mL常溫PBS輕輕潤洗細(xì)胞10~20秒，吸走PBS。

T25培養(yǎng)瓶加入1mL左右yimei，晃動使yimei均勻覆蓋瓶底，放入37℃培養(yǎng)箱消化。

消化至細(xì)胞間隙變大、細(xì)胞輕輕可吹打脫落時(shí)，加入2~3mL培養(yǎng)基終止消化，混勻細(xì)胞后900rpm離心3~5分鐘，棄上清。

用新的培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，按?1:2~1:4?比例分到新培養(yǎng)瓶，補(bǔ)足培養(yǎng)基后放回培養(yǎng)箱：T25瓶需加10-12mL培養(yǎng)基，10cm皿加12-15mL，每2~3天換液一次。

注意：該細(xì)胞消化時(shí)間偏長，經(jīng)驗(yàn)不足可每隔30秒輕吹細(xì)胞，能輕柔吹打散即終止消化，避免過度消化造成細(xì)胞損傷。

四、凍存操作

按傳代步驟消化離心獲得細(xì)胞沉淀，用預(yù)先配制的凍存液（55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO，或商業(yè)化程序性凍存液）重懸細(xì)胞，調(diào)整密度至1×10^6cells/mL。

分裝到標(biāo)記好的凍存管中，放入程序性凍存盒后置于-80℃冰箱過夜。

次日轉(zhuǎn)移至液氮中長期保存，液氮保存24小時(shí)后建議復(fù)蘇一管檢測細(xì)胞活性，合格后方可長期保存。

五、該細(xì)胞專屬注意事項(xiàng)

細(xì)胞培養(yǎng)過程中代謝會產(chǎn)生較多顆粒物，屬于正?，F(xiàn)象，不代表污染。顆粒過多時(shí)可收集細(xì)胞低速離心，PBS重懸后再次離心，重復(fù)1~2次即可改善。

細(xì)胞消耗培養(yǎng)基速度偏快，需要保證足夠的培養(yǎng)基體積，避免營養(yǎng)不足導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差。

常溫運(yùn)輸收貨后，需先在37℃培養(yǎng)箱靜置4小時(shí)以上穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，密度大于80%再進(jìn)行傳代，傳代建議比例1:2。