2026年4月29日，由美國(guó)加州大學(xué)舊金山分校（UCSF）的Amy C. Fan和Matthew F. Krummel教授研究團(tuán)隊(duì)，在國(guó)際頂尖期刊Nature在線發(fā)表題為：Submicrometre sampling of living cells by macrophages的論文。研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞與活細(xì)胞物理接觸、以非破壞性的胞啃樣機(jī)制，從活細(xì)胞中持續(xù)采取胞質(zhì)成分，并將其導(dǎo)入?yún)^(qū)別于經(jīng)典降解途徑的囊泡系統(tǒng)。

一套功能全備的免疫系統(tǒng)必須持續(xù)采集自身抗原、建立健全的自身識(shí)別體系，以此規(guī)避自身免疫病，并識(shí)別各類病原體入侵。免疫細(xì)胞發(fā)育階段，胸腺內(nèi)會(huì)將自身蛋白呈遞給 T 細(xì)胞；而全身各處也需持續(xù)進(jìn)行自身抗原呈遞，用以維持調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞庫(kù)規(guī)模，同時(shí)為常規(guī) T 細(xì)胞提供持續(xù)性基礎(chǔ)信號(hào)，保障其長(zhǎng)期存活。部分器官內(nèi)細(xì)胞持續(xù)發(fā)生凋亡，髓系細(xì)胞會(huì)攝取這些凋亡細(xì)胞碎片，基于該現(xiàn)象，學(xué)界普遍認(rèn)為持續(xù)性細(xì)胞凋亡是機(jī)體自身抗原的主要來(lái)源。本研究聯(lián)合活體成像與囊泡標(biāo)記系列技術(shù)，揭示巨噬細(xì)胞可通過(guò)另一種途徑，以非破壞性方式直接對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)取樣。該過(guò)程依賴細(xì)胞間直接接觸，不依賴半胱天冬酶激活；機(jī)制類似胞啃作用（trogocytosis）：靶細(xì)胞細(xì)胞膜被牽拉延展并伸入巨噬細(xì)胞內(nèi)部，最終形成攜帶細(xì)胞質(zhì)的亞微米級(jí)囊泡。本研究采用高通量流式囊泡標(biāo)記技術(shù)證實(shí)：取自活細(xì)胞的胞內(nèi)物質(zhì)會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的胞內(nèi)加工途徑，極少與溶酶體發(fā)生融合；同時(shí)，該類抗原對(duì) CD4?T 細(xì)胞、CD8?T 細(xì)胞的抗原呈遞效果存在顯著差異。若人為改變抗原轉(zhuǎn)運(yùn)通路，使其定向進(jìn)入溶酶體降解，巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的 CD8?T 細(xì)胞初始活化效應(yīng)會(huì)大幅減弱。上述結(jié)果證明，免疫系統(tǒng)存在一條關(guān)鍵且規(guī)模可觀的活細(xì)胞取樣通路，該機(jī)制對(duì)維持免疫耐受邊界起到?jīng)Q定性作用。

論文截圖

Scbg1a1creERT2小鼠，全稱Scgb1a1-IRES/P2A-CreERT2，是一種用于小鼠肺部特定細(xì)胞類型（主要是 Club 細(xì)胞）遺傳操作的工具小鼠品系。該品系利用 ?Scgb1a1?（Secretoglobin Family 1A Member 1，也稱 CC10/CCSP）基因的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng) CreERT2 重組酶的表達(dá)。Scgb1a1僅在終末細(xì)支氣管非纖毛分泌上皮細(xì)胞高表達(dá)，肺泡 Ⅱ 型細(xì)胞低表達(dá)，全身其他組織幾乎無(wú)表達(dá)。

ZsGreen1 是一款高亮度的綠色熒光蛋白，來(lái)源于濱珊瑚屬造礁珊瑚（Zoanthus sp. reef coral）；該蛋白經(jīng)過(guò)改造，具備高可溶性、強(qiáng)熒光發(fā)射能力與發(fā)色團(tuán)快速成熟的特性。ZsGreen1 是市售熒光蛋白中亮度頂尖的綠色熒光蛋白，亮度最高可達(dá)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的2.5倍，非常適用于全細(xì)胞標(biāo)記、啟動(dòng)子報(bào)告基因研究，也可作為轉(zhuǎn)染對(duì)照使用。ZsGreen1強(qiáng)烈表達(dá)，還可出現(xiàn)在細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicles, EVs）和可溶性組分中。

抗原呈遞細(xì)胞（APC）需持續(xù)巡查各組織，通過(guò)攝取、加工抗原并完成抗原呈遞，介導(dǎo)抗原特異性 T 細(xì)胞應(yīng)答。此前，研究者在研究多種組織特異性免疫耐受位點(diǎn)（含腫瘤組織）時(shí)，在多種更新速率各異的非炎癥組織中表達(dá)熒光蛋白 ZsGreen：一類為細(xì)胞更新緩慢的組織（如Scbg1a1creERT2標(biāo)記氣道上皮細(xì)胞），另一類為細(xì)胞更新較快的組織（如K14cre標(biāo)記皮膚細(xì)胞、腫瘤組織、Vil1cre標(biāo)記腸道上皮細(xì)胞）。ZsGreen 熒光亮度高、穩(wěn)定性強(qiáng)，可實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)效示蹤。

本研究中，在Scbg1a1creERT2與K14cre啟動(dòng)子調(diào)控下表達(dá)胞質(zhì) ZsGreen 后，均可穩(wěn)定觀察到大量 CD45?免疫細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)存在大量攜帶 ZsGreen 的亞微米級(jí)囊泡點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)（圖 1a、b），該現(xiàn)象提示免疫細(xì)胞攝取了組織來(lái)源蛋白。研究人員從上述健康組織中分選獲得含 ZsGreen 信號(hào)的 CD45?細(xì)胞，結(jié)果顯示多種髓系細(xì)胞均攜帶熒光信號(hào)（圖 1c、d），包括樹(shù)突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞；其中巨噬細(xì)胞的熒光負(fù)載比例最高，且該攝取規(guī)律與既往研究中髓系細(xì)胞攝取皮膚組織組分、腫瘤胞質(zhì)片段的特征高度吻合。

圖1.髓系細(xì)胞可從正常組織與腫瘤組織中攝取蛋白。

上述熒光信號(hào)現(xiàn)象是否由轉(zhuǎn)基因在宿主組織中異位表達(dá)造成？答案為否的證據(jù)如下。第一，研究人員對(duì)比了三類小鼠肺臟髓系細(xì)胞的 ZsGreen 熒光強(qiáng)度：全身廣譜表達(dá) ZsGreen 小鼠（Actbcre;ZsGreen）、肺特異性表達(dá) ZsGreen 小鼠（Scgb1a1creERT2;ZsGreen）、無(wú) ZsGreen 表達(dá)的 C57BL/6 野生型小鼠（B6 WT）。在所有髓系細(xì)胞亞群中，Scgb1a1creERT2;ZsGreen小鼠的 ZsGreen 熒光強(qiáng)度均高于野生型 B6 小鼠，但低于全身廣譜標(biāo)記的Actbcre;ZsGreen小鼠。該結(jié)果說(shuō)明，髓系細(xì)胞內(nèi)的 ZsGreen 來(lái)源于外源攝取，而非細(xì)胞自身表達(dá)。

第二，將正常骨髓移植至 ZsGreen 標(biāo)記小鼠體內(nèi)后，供體來(lái)源的髓系細(xì)胞均呈現(xiàn)強(qiáng) ZsGreen 熒光信號(hào)。第三，給全身表達(dá) tdTomato 熒光蛋白的小鼠皮下移植穩(wěn)定表達(dá) ZsGreen 的 B16-F10 黑色素瘤細(xì)胞（B16-ZsGreen），宿主 CD45?免疫細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)來(lái)源于腫瘤的 ZsGreen 陽(yáng)性囊泡點(diǎn)狀結(jié)構(gòu)；且相當(dāng)比例的腫瘤相關(guān)髓系細(xì)胞均攝取了 ZsGreen 熒光信號(hào)（圖 1e、f）。最后，該團(tuán)隊(duì)前期研究證實(shí)組織特異性 ZsGreen 可轉(zhuǎn)運(yùn)至該組織引流淋巴結(jié)，而Scgb1a1creERT2;ZsGreen小鼠的非引流淋巴結(jié)中未檢測(cè)到 ZsGreen 信號(hào)（圖 1g），證明該蛋白攝取具有組織特異性。

針對(duì)腫瘤抗原，已有研究證實(shí)腫瘤抗原會(huì)與腫瘤來(lái)源 ZsGreen 示蹤蛋白共同包裹于巨噬細(xì)胞囊泡內(nèi)。為明確更新速率緩慢的健康組織（如上皮組織）中的其他非腫瘤自身抗原是否也能被髓系細(xì)胞以相同方式攝取，本研究檢測(cè)了 VEGFR3 與 PLVAP 蛋白表達(dá)水平，這兩種蛋白特異性表達(dá)于肺臟非造血細(xì)胞表面。對(duì)Scgb1a1creERT2;ZsGreen小鼠肺組織細(xì)胞組分開(kāi)展胞內(nèi)流式分析，結(jié)果顯示：僅肺局部髓系細(xì)胞攜帶上述自身蛋白，遠(yuǎn)端脾臟髓系細(xì)胞無(wú)該信號(hào)（圖 1h、i）。此外，ZsGreen 高表達(dá)髓系細(xì)胞的 VEGFR3、PLVAP 染色熒光強(qiáng)度顯著高于 ZsGreen 低表達(dá)髓系細(xì)胞（圖 1h）。綜上，組織原位髓系細(xì)胞會(huì)持續(xù)攝取組織自身蛋白，既包括人工表達(dá)的示蹤熒光蛋白，也包含組織天然表達(dá)的內(nèi)源蛋白。

巨噬細(xì)胞可對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行物質(zhì)取樣

體內(nèi)髓系細(xì)胞攝取組織物質(zhì)存在多種潛在機(jī)制，目前研究最充分的兩種為凋亡細(xì)胞吞噬、胞外囊泡胞吞。為精細(xì)解析髓系細(xì)胞獲取鄰近細(xì)胞胞內(nèi)組分的具體途徑，研究人員構(gòu)建體外細(xì)胞取樣檢測(cè)體系：選用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞活力約 99% 的供體細(xì)胞開(kāi)展共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM）與 ZsGreen 陽(yáng)性靶細(xì)胞共培養(yǎng)，選用兩種經(jīng)典靶細(xì)胞模型：B16-ZsGreen 黑色素瘤細(xì)胞（該培養(yǎng)條件下胞外囊泡分泌量極低）、分離自全身 ZsGreen 標(biāo)記小鼠的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（MEF-ZsGreen）。

共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種靶細(xì)胞均可被 BMDM 顯著攝取 ZsGreen 熒光信號(hào)；且巨噬細(xì)胞內(nèi) ZsGreen 熒光強(qiáng)度僅為完整靶細(xì)胞的數(shù)百分之一，提示該過(guò)程僅為局部物質(zhì)攝取，而非完整細(xì)胞吞噬（圖 2a）。分選獲得 ZsGreen 陽(yáng)性 BMDM 后，利用高分辨轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡成像，可清晰觀察到細(xì)胞內(nèi)部存在亞微米級(jí) ZsGreen 陽(yáng)性點(diǎn)狀囊泡結(jié)構(gòu)（圖 2b、c）。

圖2.活細(xì)胞可通過(guò)依賴細(xì)胞間接觸的方式被攝取胞質(zhì)組分，且該過(guò)程不依賴半胱天冬酶激活。

隨后我們探究該體系中活細(xì)胞抗原攝取是否依賴可溶性顆粒攝取，或是需要細(xì)胞間直接接觸；其中游離外泌體、凋亡小泡的攝取主要依靠可溶性顆粒途徑。我們?cè)O(shè)置兩組共培養(yǎng)體系：一組將骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM）與 B16-ZsGreen 細(xì)胞 48 小時(shí)培養(yǎng)上清（含少量外泌體）共孵育；另一組采用 Transwell 小室將 B16-ZsGreen 靶細(xì)胞與巨噬細(xì)胞物理分隔。兩組處理均顯著降低巨噬細(xì)胞對(duì) ZsGreen 的攝取效率（圖 2d、e）。此外，向共培養(yǎng)體系加入外泌體 / 微顆粒釋放抑制劑或胞吞抑制劑，均無(wú)法抑制該攝取過(guò)程（圖 2f、g）。以上結(jié)果表明，盡管外泌體、微顆粒等可溶性物質(zhì)的胞吞作用會(huì)微弱參與該過(guò)程，但本體系中巨噬細(xì)胞攝取活細(xì)胞胞內(nèi)物質(zhì)存在一條獨(dú)立的主導(dǎo)通路，且該通路必須依賴細(xì)胞間直接接觸。

現(xiàn)有假說(shuō)認(rèn)為，凋亡小體的吞噬（即胞葬作用，本文統(tǒng)一稱吞噬作用）是組織向巡視型抗原呈遞細(xì)胞輸送自身組分的主要途徑。因此本研究進(jìn)一步驗(yàn)證：細(xì)胞凋亡是否是本體系中大量細(xì)胞物質(zhì)攝取的必要條件。向共培養(yǎng)體系加入半胱天冬酶抑制劑 zVAD 后，巨噬細(xì)胞攝取 ZsGreen 的效率未發(fā)生任何改變（圖 2h），證實(shí)該攝取機(jī)制不依賴細(xì)胞凋亡。為更直觀確認(rèn)巨噬細(xì)胞內(nèi)攝取的物質(zhì)是否來(lái)源于凋亡細(xì)胞，研究人員選用改造后的 B16-F10 報(bào)告細(xì)胞株（B16-GC3AI）：該細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)組成型 mCherry 紅色熒光，同時(shí)攜帶分裂型 GFP 胱天蛋白酶 3 活性報(bào)告元件 —— 僅當(dāng)胱天蛋白酶 3 被剪切激活（如細(xì)胞凋亡時(shí)），GFP 才會(huì)發(fā)出熒光（圖 2i）。該模型驗(yàn)證結(jié)果顯示：實(shí)驗(yàn)體系內(nèi) B16-GC3AI 細(xì)胞活力高，GFP 陽(yáng)性細(xì)胞僅占 0.12%；而星形孢菌素誘導(dǎo)凋亡后，GFP 陽(yáng)性細(xì)胞占比超 63%（圖 2i）。將該報(bào)告細(xì)胞與 BMDM 共培養(yǎng)后，絕大多數(shù)攝取了靶細(xì)胞組分的 mCherry 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞無(wú) GFP 熒光信號(hào)；與凋亡誘導(dǎo)組形成鮮明對(duì)比：活細(xì)胞取樣組僅 1% 巨噬細(xì)胞攜帶凋亡 GFP 信號(hào)，星形孢菌素凋亡處理組則達(dá) 11%（圖 2j）。綜上，本研究證實(shí)機(jī)體存在一條獨(dú)立于凋亡通路的新型物質(zhì)攝取途徑，用于獲取活細(xì)胞胞內(nèi)組分。

活細(xì)胞實(shí)時(shí)成像觀測(cè)活細(xì)胞取樣過(guò)程

鑒于巨噬細(xì)胞內(nèi)攝取的囊泡尺寸極小，本研究采用高分辨成像技術(shù)，實(shí)時(shí)記錄共培養(yǎng)體系中膜定位 tdTomato 標(biāo)記的 BMDM 與 B16-ZsGreen 靶細(xì)胞的互作全過(guò)程。所用成像設(shè)備包括晶格光片顯微鏡（各向同性分辨率約 220 納米）、尼康空間陣列共聚焦檢測(cè)系統(tǒng)（NSPARC，超低噪聲探測(cè)器陣列，橫向分辨率約 212 納米，軸向分辨率約 424 納米）。兩種成像技術(shù)均可長(zhǎng)時(shí)間完整掃描活細(xì)胞三維結(jié)構(gòu)，且光毒性更低。

借助 NSPARC 顯微成像系統(tǒng)，研究人員觀測(cè)到靶細(xì)胞與 BMDM 自發(fā)發(fā)生互作：靶細(xì)胞伸出突起并被拉入巨噬細(xì)胞內(nèi)部，隨后分離形成獨(dú)立的 ZsGreen 陽(yáng)性囊泡（圖 3b）。代表性動(dòng)態(tài)視頻記錄完整過(guò)程（圖 3b，補(bǔ)充視頻 1）：從初次觀測(cè)到 ZsGreen 陽(yáng)性突起，至突起脫離靶細(xì)胞，全程不足 10 分鐘；囊泡的斷裂分離僅發(fā)生在單幀成像間隔內(nèi)（30 秒，圖 3a、b），剩余連接絲隨后消失，要么被囊泡一同攝入巨噬細(xì)胞，要么回縮回靶細(xì)胞。研究人員通過(guò) yz、xz 切面投影分析同一組成像數(shù)據(jù)，證實(shí)該過(guò)程結(jié)束后，靶細(xì)胞微量胞質(zhì)組分確實(shí)進(jìn)入巨噬細(xì)胞內(nèi)部。與體內(nèi)實(shí)驗(yàn)觀測(cè)到的尺寸區(qū)間一致，分離形成的囊泡體積微小，下限接近衍射極限（體積＜0.02 μm3），最大約 0.05 μm3（圖 3c）。部分觀測(cè)案例中，靶細(xì)胞突起被巨噬細(xì)胞牽拉后又回縮，未形成可檢測(cè)的囊泡，該現(xiàn)象可能對(duì)應(yīng)極微量物質(zhì)攝取，或是中途終止的不攝取。攝取完成后，ZsGreen 陽(yáng)性點(diǎn)狀囊泡可在巨噬細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)自由移動(dòng)。上述結(jié)果證明，巨噬細(xì)胞可通過(guò)依賴細(xì)胞接觸、類似胞啃作用的方式攝取活細(xì)胞胞質(zhì)組分。

圖3.類似胞啃作用的攝取模式使巨噬細(xì)胞能夠攝取活細(xì)胞內(nèi)的胞質(zhì)蛋白。

為證實(shí)該現(xiàn)象并非檢測(cè)手段造成的人工假象，并利用更高成像幀率開(kāi)展觀測(cè)，y研究人員采用晶格光片顯微鏡開(kāi)展實(shí)驗(yàn)，該設(shè)備具備各向同性高分辨率。這套成像系統(tǒng)同樣捕捉到 ZsGreen 陽(yáng)性囊泡的牽拉與斷裂過(guò)程，囊泡分離僅發(fā)生在單幀成像間隔內(nèi)（晶格光片顯微鏡單幀間隔約 8 秒；圖 3d）。盡管轉(zhuǎn)盤共聚焦顯微鏡偶爾也能捕捉到攝取的囊泡，但這類囊泡體積極?。偀晒猱a(chǎn)量低），且該成像方式采樣速率偏低，傳統(tǒng)顯微技術(shù)很難捕捉到這一生物學(xué)過(guò)程。這也解釋了為何以往采用常規(guī)顯微手段的研究均未報(bào)道、也未深入探究該機(jī)制。

活細(xì)胞的受體介導(dǎo)型物質(zhì)攝取

多種受體 - 配體相互作用均可能參與該過(guò)程，研究者首先探究已知機(jī)制（如抗體調(diào)理作用、補(bǔ)體受體 3（CR3，由 CD11b–CD18 異二聚體構(gòu)成）結(jié)合）是否促進(jìn)巨噬細(xì)胞攝取活細(xì)胞組分。提前用靶向膜蛋白 CD98 的抗體孵育靶細(xì)胞，可提升 ZsGreen 攝取水平（圖 3e）。已有研究證實(shí)大鼠 IgG1κ 可特異性結(jié)合 Fcγ 受體 3（FcγR3，又稱 CD16），而該攝取增強(qiáng)效應(yīng)依賴 FcγR3 的結(jié)合與下游信號(hào)傳導(dǎo)（圖 3e、f）。提前用靶向另一高豐度膜蛋白 CD29 的抗體孵育靶細(xì)胞，同樣以 Fcγ 受體依賴的方式提升攝取效率。此外，將 ZsGreen 陽(yáng)性靶細(xì)胞與正常小鼠血清或純化 IgG 預(yù)孵育后，再與骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)，巨噬細(xì)胞的 ZsGreen 攝取量顯著上升。該結(jié)果表明，即便交叉反應(yīng)活性較弱的多克隆抗體，也能促進(jìn)巨噬細(xì)胞對(duì)活細(xì)胞組分的攝取。同時(shí)，敲除巨噬細(xì)胞內(nèi)補(bǔ)體受體亞基 CD11b 后，巨噬細(xì)胞攝取 B16 細(xì)胞、小鼠胚胎成纖維細(xì)胞 ZsGreen 信號(hào)的陽(yáng)性比例與熒光強(qiáng)度均下降（圖 3g），該現(xiàn)象與既往報(bào)道中小膠質(zhì)細(xì)胞依靠該類受體完成突觸修剪的機(jī)制相似。

為篩選除 CD11b、Fcγ 受體外參與該過(guò)程的其他膜蛋白，研究人員利用 NicheNet 工具預(yù)測(cè)兩種靶細(xì)胞模型與骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞間的配體 - 受體互作關(guān)系。鑒于 CD11b 已被證實(shí)參與吞噬作用，研究人員優(yōu)先篩選具備已知吞噬功能的共有受體，驗(yàn)證其蛋白表達(dá)水平并評(píng)估其對(duì) ZsGreen 攝取的影響。在檢測(cè)的 8 個(gè)候選受體中，僅編碼 C 型凝集素受體的Cd93基因敲除組，ZsGreen 攝取量出現(xiàn)小幅但具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的下降。上述結(jié)果說(shuō)明，多種細(xì)胞膜間相互作用共同介導(dǎo)物質(zhì)攝取，CD11b 與 CD93 僅發(fā)揮部分調(diào)控作用。

隨后研究者使用小分子抑制劑，探究連接受體結(jié)合與物質(zhì)攝取的下游信號(hào)通路。靶向檢測(cè) CD11b 下游信號(hào)分子（SRC、SYK、PI3K）、參與囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)的小 GTP 酶（ARF6、CDC42、RAC）以及肌動(dòng)蛋白成核蛋白（ARP2/3 復(fù)合體、成蛋白家族）。使用 PP1 抑制 SRC 信號(hào)、GDC-0941 抑制 PI3K 信號(hào)、CK-666 抑制 ARP2/3 復(fù)合體后，巨噬細(xì)胞的物質(zhì)攝取水平下降，但未被阻斷。結(jié)果提示：受體激活 SRC 與 PI3K 通路，進(jìn)而通過(guò) ARP2/3 介導(dǎo)分支肌動(dòng)蛋白組裝，推動(dòng)囊泡形成。與之相反，SYK、小 GTP 酶以及成蛋白調(diào)控的線性肌動(dòng)蛋白通路在本體系中并非必需，或存在功能冗余。綜上，多條通路協(xié)同調(diào)控這種依賴細(xì)胞接觸的物質(zhì)攝取過(guò)程，且該過(guò)程依賴細(xì)胞接觸界面的局部激活信號(hào)。

活細(xì)胞取樣產(chǎn)物的獨(dú)特胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑

研究人員進(jìn)一步探究該攝取途徑形成的囊泡及其內(nèi)含物是否存在獨(dú)特下游功能效應(yīng)，首先對(duì)比其轉(zhuǎn)運(yùn)命運(yùn)與吞噬、胞吞途徑攝取物質(zhì)的差異。為實(shí)現(xiàn)不同攝取途徑來(lái)源細(xì)胞器的高維分析，研究人員參考既往 phagoFACS 技術(shù)，建立一套包含十項(xiàng)檢測(cè)參數(shù)的流式細(xì)胞器圖譜分析方法，可對(duì)多種胞內(nèi)區(qū)室開(kāi)展免疫分型（圖 4a）。為特異性分析結(jié)合胞質(zhì)蛋白的胞內(nèi)細(xì)胞器，研究人員在細(xì)胞裂解前對(duì)細(xì)胞膜進(jìn)行生物素標(biāo)記，精準(zhǔn)區(qū)分細(xì)胞膜來(lái)源膜結(jié)構(gòu)；同時(shí)使用結(jié)合氨基的 CellTrace Violet 染料進(jìn)行染色（圖 4b）。早期內(nèi)體抗原 1（EEA1）、RAB7 等胞內(nèi)細(xì)胞器標(biāo)志物僅在鏈霉親和素陰性組分中檢出（圖 4c）。從骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞中分選 CellTrace Violet 陽(yáng)性胞內(nèi)囊泡，可區(qū)分出攜帶 ZsGreen 抗原的囊泡與無(wú) ZsGreen 抗原的空白囊泡；且該類 ZsGreen 陽(yáng)性囊泡僅存在于與 ZsGreen 陽(yáng)性靶細(xì)胞共培養(yǎng)的巨噬細(xì)胞內(nèi)（圖 4d）。

圖4.多參數(shù)胞內(nèi)囊泡流式細(xì)胞術(shù)證實(shí)，來(lái)源于活細(xì)胞的蛋白定位于一類獨(dú)立囊泡區(qū)室。

現(xiàn)有認(rèn)知認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)化形成的囊泡會(huì)沿一條逐步走向降解的通路轉(zhuǎn)運(yùn)：早期內(nèi)體成熟為晚期內(nèi)體，晚期內(nèi)體再與溶酶體融合形成吞噬溶酶體。本研究設(shè)計(jì)了一套抗體組合，用于識(shí)別各類已知囊泡區(qū)室，包括 RAB17 陽(yáng)性循環(huán)內(nèi)體、EEA1 陽(yáng)性早期內(nèi)體、LAMP1 陽(yáng)性溶酶體、RAB7 陽(yáng)性成熟內(nèi)體，以及 RAB7?LAMP1?CD63?晚期內(nèi)體（圖 4e–h）。研究人員額外加入識(shí)別抗原提呈分子 MHCⅠ 類分子（MHC-Ⅰ）與 MHCⅡ 類分子（MHC-Ⅱ）的抗體，以此鑒定具備抗原裝載功能的囊泡區(qū)室。與已有報(bào)道一致，MHC-Ⅰ 基本不分布于 LAMP1 陽(yáng)性囊泡，而 MHC-Ⅱ 可在多種囊泡區(qū)室中檢出。上述結(jié)果證明，這套高維囊泡分析方法適用于解析囊泡區(qū)室的組分與分型。

隨后研究者采用該細(xì)胞器免疫分型技術(shù)，對(duì)比類胞啃活細(xì)胞取樣、胞吞、吞噬這三種不同攝取方式所形成 ZsGreen 陽(yáng)性抗原囊泡的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)差異（圖 4i）。盡管攝取上清可溶性物質(zhì)的胞吞途徑僅能產(chǎn)生極低水平 ZsGreen 信號(hào)，但仍可檢出足量 ZsGreen 囊泡用于后續(xù)分析。常規(guī)分群分析顯示，吞噬與胞吞兩種途徑的抗原均分布于囊泡成熟通路的各個(gè)階段；但類胞啃取樣產(chǎn)生的囊泡向晚期內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)的比例顯著降低（圖 4j、k），且該類囊泡與 MHC-Ⅰ 的共定位程度隨靶細(xì)胞類型變化，MHC-Ⅱ 則無(wú)此現(xiàn)象。值得注意的是，約 90% 吞噬途徑來(lái)源的 ZsGreen 陽(yáng)性囊泡可被經(jīng)典內(nèi)體標(biāo)志物標(biāo)記，而活細(xì)胞取樣產(chǎn)生的 ZsGreen 囊泡有相當(dāng)比例不結(jié)合這些標(biāo)準(zhǔn)內(nèi)吞標(biāo)志物（圖 4l）。該結(jié)果說(shuō)明，活細(xì)胞攝取的胞質(zhì)組分進(jìn)入一條獨(dú)立于降解通路的新型內(nèi)吞轉(zhuǎn)運(yùn)途徑。

為無(wú)偏分析各類標(biāo)志物熒光強(qiáng)度并區(qū)分不同囊泡亞群，研究人員將所有 ZsGreen 陽(yáng)性囊泡數(shù)據(jù)整合，僅以囊泡蛋白標(biāo)志物熒光強(qiáng)度為參數(shù)繪制 t 分布隨機(jī)鄰域嵌入（tSNE）圖。結(jié)果顯示，三種取樣方式產(chǎn)生的囊泡群存在部分重疊，但對(duì)比類胞啃活細(xì)胞取樣與常規(guī)凋亡細(xì)胞吞噬，兩類囊泡的整體分布存在明顯偏移（圖 4m）。疊加 LAMP1 等標(biāo)志物熒光強(qiáng)度后可見(jiàn)，與常規(guī)流式分群結(jié)果吻合：活細(xì)胞取樣來(lái)源囊泡晚期內(nèi)體標(biāo)志物表達(dá)偏低，大量富集于一類獨(dú)特囊泡區(qū)室（圖 4m）。

為獨(dú)立驗(yàn)證囊泡向溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)效率，研究人員開(kāi)展共聚焦顯微成像與定量共定位分析。結(jié)果證實(shí)，經(jīng)活細(xì)胞取樣獲得的 ZsGreen 熒光信號(hào)與 LAMP1 溶酶體標(biāo)志物的共定位程度，顯著低于吞噬途徑獲取的抗原。該結(jié)論進(jìn)一步證明，來(lái)源于活細(xì)胞的抗原擁有獨(dú)特的囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)命運(yùn)。

活細(xì)胞取樣偏向激活 T 細(xì)胞

從免疫學(xué)角度，抗原攝取方式會(huì)影響內(nèi)化抗原通過(guò) MHC-Ⅰ 交叉提呈、MHC-Ⅱ 常規(guī)提呈激活 T 細(xì)胞的效果。為探究該類胞啃攝取機(jī)制對(duì)抗原提呈的調(diào)控作用，研究人員構(gòu)建 B16-ZsGreen-minOVA 細(xì)胞，該細(xì)胞表達(dá)融合 ZsGreen 的 OT-I、OT-II 卵清蛋白（OVA）抗原肽；分別用 DMSO、星形孢菌素處理該細(xì)胞后與骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞（BMDM）共培養(yǎng)，分離獲得攝取抗原的 ZsGreen 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞（圖 4n）。將攝取凋亡細(xì)胞抗原的巨噬細(xì)胞（吞噬組 BMDM）與攝取活細(xì)胞組分的巨噬細(xì)胞（胞啃組 BMDM）分別共孵育 CD4? OT-II T 細(xì)胞，兩組 T 細(xì)胞活化水平均較弱且無(wú)明顯差異（圖 4o）。與之相反，僅胞啃組巨噬細(xì)胞可顯著誘導(dǎo) CD8? OT-I T 細(xì)胞早期活化（CD69 上調(diào)）與增殖（圖 4p）。該結(jié)果與活細(xì)胞取樣物質(zhì)極少轉(zhuǎn)運(yùn)至降解型晚期內(nèi)體、溶酶體的結(jié)論相符，說(shuō)明該途徑更偏向抗原交叉提呈。

已有研究報(bào)道樹(shù)突狀細(xì)胞可通過(guò)胞啃實(shí)現(xiàn)細(xì)胞膜跨細(xì)胞轉(zhuǎn)移（膜裝飾效應(yīng)）并激活 T 細(xì)胞。為驗(yàn)證本體系是否存在該現(xiàn)象，研究人員使用 BALB/c 小鼠來(lái)源巨噬細(xì)胞開(kāi)展抗原轉(zhuǎn)移與 T 細(xì)胞刺激實(shí)驗(yàn)。單獨(dú)培養(yǎng)的 BALB/c 巨噬細(xì)胞、以及攝取 B16-ZsGreen-minOVA 靶細(xì)胞組分的 ZsGreen 陽(yáng)性 BALB/c 巨噬細(xì)胞，均無(wú)法檢測(cè)到靶細(xì)胞來(lái)源 MHC-Ⅰ 等位基因 H2Kb。與此一致，ZsGreen 陽(yáng)性 BALB/c 巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)抗原特異性 CD8 T 細(xì)胞增殖的能力遠(yuǎn)弱于 B6 小鼠來(lái)源對(duì)照巨噬細(xì)胞。由此可見(jiàn)，盡管存在微量肽 - MHC 復(fù)合物轉(zhuǎn)移，但絕大多數(shù) CD8 T 細(xì)胞活化仍依賴巨噬細(xì)胞對(duì)攝取胞質(zhì)抗原的加工與提呈。

轉(zhuǎn)運(yùn)通路偏移與抗原初次活化強(qiáng)度相關(guān)

經(jīng)網(wǎng)格蛋白非依賴、動(dòng)力蛋白非依賴型胞吞攝取的物質(zhì)會(huì)避開(kāi)溶酶體降解通路；SNX27 - 分選連接蛋白復(fù)合物可阻斷內(nèi)化物質(zhì)向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)（圖 5a）。本研究中的活細(xì)胞取樣同樣不依賴動(dòng)力蛋白，且抗原走非降解轉(zhuǎn)運(yùn)通路，因此研究人員探究敲除 SNX27 對(duì)抗原轉(zhuǎn)運(yùn)及后續(xù) T 細(xì)胞應(yīng)答的影響。利用 CRISPR-Cas9 技術(shù)靶向敲除巨噬細(xì)胞 Snx27 基因，可高效引入基因插入 / 缺失突變，大幅下調(diào) SNX27 蛋白表達(dá)（圖 5b、c）。Snx27 敲除不影響巨噬細(xì)胞攝取 ZsGreen 示蹤蛋白；但相較于靶向 Rosa26 位點(diǎn)的對(duì)照組，Snx27 敲除會(huì)促使更多 ZsGreen 抗原轉(zhuǎn)運(yùn)至 LAMP1 陽(yáng)性溶酶體，同時(shí)減少進(jìn)入獨(dú)特非降解囊泡區(qū)室的抗原比例（圖 5d、e）。該結(jié)果證明，活細(xì)胞攝取的胞質(zhì)組分在進(jìn)入細(xì)胞后，依靠 SNX27 介導(dǎo)的通路避開(kāi)溶酶體降解。

圖5.巨噬細(xì)胞敲除 Snx27 會(huì)促進(jìn)抗原向溶酶體轉(zhuǎn)運(yùn)，并抑制 CD8 陽(yáng)性 T 細(xì)胞活化。

為明確上述轉(zhuǎn)運(yùn)通路改變是否會(huì)造成交叉提呈能力下降，研究者將 Snx27 敲除型與對(duì)照組骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞分別和 B16-ZsGreen-minOVA 靶細(xì)胞共培養(yǎng)，再分選出 ZsGreen 陽(yáng)性巨噬細(xì)胞，與 OT-I CD8? T 細(xì)胞共孵育。與抗原降解增多的結(jié)果一致，Snx27 敲除巨噬細(xì)胞誘導(dǎo) T 細(xì)胞增殖的能力顯著減弱（圖 5f）。值得注意的是，若直接用 SL8 短肽刺激巨噬細(xì)胞，Snx27 敲除并不會(huì)抑制 T 細(xì)胞增殖。該結(jié)果證實(shí)，上述抑制效應(yīng)源于抗原加工過(guò)程發(fā)生改變，并非抗原提呈細(xì)胞本身功能存在普遍性缺陷。

擴(kuò)展討論

綜上，上述研究結(jié)果證實(shí)：巨噬細(xì)胞可通過(guò)一種類似胞啃作用的機(jī)制大量攝取活細(xì)胞組分，攝取的物質(zhì)會(huì)儲(chǔ)存在一類獨(dú)特囊泡區(qū)室中，該囊泡極少向晚期內(nèi)體轉(zhuǎn)運(yùn)。巨噬細(xì)胞本就能持續(xù)少量攝取活細(xì)胞內(nèi)容物，這一點(diǎn)本身并不出人意料。已有研究證實(shí)，巨噬細(xì)胞的修剪功能對(duì)干細(xì)胞活化至關(guān)重要[1]，還可通過(guò)微量突觸修剪優(yōu)化大腦神經(jīng)環(huán)路結(jié)構(gòu)[2]。

本研究的核心創(chuàng)新點(diǎn)在于：研究者發(fā)現(xiàn)一種低攝取量的類胞啃取樣過(guò)程，該過(guò)程在多種細(xì)胞穩(wěn)態(tài)下持續(xù)發(fā)生，是健康細(xì)胞自身抗原的重要來(lái)源。該通路為巨噬細(xì)胞提供了一套特殊的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑，使其能夠?qū)⒔】底陨砜乖禺愋蕴岢式o CD8? T 細(xì)胞。

既往僅有一項(xiàng)研究報(bào)道樹(shù)突狀細(xì)胞的胞啃現(xiàn)象，該研究聚焦經(jīng)典 “撕扯式” 胞啃機(jī)制，僅實(shí)現(xiàn)靶細(xì)胞膜上預(yù)組裝的肽 - MHC 復(fù)合物直接轉(zhuǎn)移。與之不同，本研究借助此前尚未普及的囊泡流式分析技術(shù)證實(shí)，攝取的胞質(zhì)組分可儲(chǔ)存于抗原提呈細(xì)胞內(nèi)部的儲(chǔ)備囊泡中，供細(xì)胞后續(xù)加工與抗原提呈。這種穩(wěn)定的自身抗原儲(chǔ)備庫(kù)，可整合并持續(xù)呈遞多種靶細(xì)胞的自身特征，作用時(shí)長(zhǎng)可達(dá)數(shù)日甚至更久。

經(jīng)由該類胞啃途徑攝取的物質(zhì)留存時(shí)間更長(zhǎng)，由此形成的囊泡庫(kù)可在髓系細(xì)胞間相互交換，這一現(xiàn)象此前已有報(bào)道。本研究采用模式抗原與轉(zhuǎn)基因 T 細(xì)胞體系，證實(shí)巨噬細(xì)胞具備交叉提呈活細(xì)胞來(lái)源抗原、誘導(dǎo) T 細(xì)胞增殖的能力。但該交叉提呈通路在維持、調(diào)控胸腺自身耐受穩(wěn)態(tài) T 細(xì)胞庫(kù)中的生理功能，仍有待進(jìn)一步探究。

總而言之，本研究搭建了一套理論框架，用以闡釋免疫系統(tǒng)如何持續(xù)收集機(jī)體健康自身細(xì)胞的信息。該通路可根據(jù)機(jī)體自身蛋白的正常表達(dá)水平調(diào)控 T 細(xì)胞應(yīng)答；但與此同時(shí)，腫瘤細(xì)胞也可能利用該通路誘導(dǎo)病理性免疫反應(yīng)。

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關(guān)聯(lián)閱讀

1.《Science》:巨噬細(xì)胞通過(guò)胞啃作用介導(dǎo)膜物質(zhì)轉(zhuǎn)移到造血干細(xì)胞HSC

2.《Science》:巨噬細(xì)胞是造血干細(xì)胞質(zhì)量的控制者

3.《Science》:巨噬細(xì)胞-HSC相互作用并定義造血克隆性

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參考文獻(xiàn)

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