以Nut. Commun.最新文章為例│詳解藻類培養(yǎng)與表型研究產(chǎn)品應(yīng)用：實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化提高聚球藻的波動(dòng)光耐受性

Background

在自然界中，光照強(qiáng)度時(shí)刻處于動(dòng)態(tài)波動(dòng)狀態(tài)，波動(dòng)光（Fluctuating light, FL)脅迫一直是藍(lán)藻、微藻光合生長(zhǎng)的重要制約因素。劇烈光強(qiáng)起伏會(huì)破壞光合系統(tǒng)、引發(fā)光抑制，不僅影響藻類天然生長(zhǎng)，更嚴(yán)重限制了光生物反應(yīng)器工程藻株培育、光合機(jī)理研究與作物耐逆育種挖掘。盡管已有關(guān)于關(guān)鍵FL耐受性組分的研究報(bào)道，但其遺傳機(jī)制等仍未明確：

? 已發(fā)現(xiàn)部分基因、蛋白參與波動(dòng)光響應(yīng)，但缺乏可應(yīng)用的優(yōu)良耐受等位基因；

? 傳統(tǒng)培養(yǎng)方式無(wú)法精準(zhǔn)模擬梯度波動(dòng)光，難以開展長(zhǎng)期適應(yīng)性實(shí)驗(yàn)室進(jìn)化（ALE）；

? 常規(guī)檢測(cè)手段只能測(cè)生長(zhǎng)量，無(wú)法快速無(wú)損評(píng)估光合系統(tǒng)活性、篩選表型變異菌株；

? 恒定強(qiáng)光與波動(dòng)光耐受機(jī)制獨(dú)立，普通培養(yǎng)和檢測(cè)體系難以區(qū)分兩類脅迫表型。

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在實(shí)驗(yàn)室尺度，如何精準(zhǔn)模擬自然波動(dòng)光環(huán)境、實(shí)現(xiàn)藻類長(zhǎng)期馴化培養(yǎng)？如何高通量篩選光合表型差異菌株、解析光耐受生理機(jī)制？這就不得不借助一些專業(yè)的科研設(shè)備：

v 藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測(cè)技術(shù)

u LED光源精準(zhǔn)調(diào)控，單個(gè)或多種光質(zhì)、光強(qiáng)無(wú)極調(diào)控，自定義光照程序

u 環(huán)境參數(shù)控制：溫度、通氣、pH、濁度可控

u 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)曲線（OD）

u 實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)葉綠素?zé)晒狻?/span>pH、溶解氧等

u 不同通道數(shù)、不同規(guī)模高通量培養(yǎng)：同步培養(yǎng)1到多個(gè)通道，容積從100mL到數(shù)十升

v 葉綠素?zé)晒鉁y(cè)量與成像技術(shù)

u 無(wú)損測(cè)量藻類熒光參數(shù)，靈敏反映光合活性

u 多場(chǎng)景應(yīng)用，便攜式、臺(tái)式、顯微鏡式等型號(hào)，滿足各類場(chǎng)景需求

u 熒光成像系統(tǒng)高通量測(cè)量，可同時(shí)測(cè)96wells

u 多種內(nèi)置測(cè)量程序，兼?zhèn)湔{(diào)制式、非調(diào)制式測(cè)量功能

u 參考文獻(xiàn)眾多，數(shù)據(jù)、圖像可直接發(fā)文章

Typical case

接下來(lái)，我們以Nature Communications最新發(fā)表的文章（Improving tolerance to fluctuating light through adaptive laboratory evolution in the cyanobacterium Synechocystis）為案例，從實(shí)際研究出發(fā)，詳解易科泰藻類培養(yǎng)與研究技術(shù)的應(yīng)用。

先說(shuō)結(jié)論：

本研究通過(guò)在兩種FL條件下（其中一種對(duì)起始菌株具有致死性，記為LT）對(duì)集胞藻PCC 6803進(jìn)行進(jìn)化改造，依靠標(biāo)準(zhǔn)化藻類馴化培養(yǎng) + 光合熒光表型精準(zhǔn)監(jiān)測(cè)全套技術(shù)，篩選出Pam68、RpaB、Sll0518 三大關(guān)鍵突變基因，其中Pam68（PSII 組裝蛋白）和Sll0518基因突變可增強(qiáng)對(duì)非致死性FL的耐受性；而RpaB（藻膽體結(jié)合調(diào)節(jié)因子B）的功能獲得性缺失突變則顯著增強(qiáng)了對(duì)致死性FL及強(qiáng)光條件的耐受性。

n 實(shí)驗(yàn)室適應(yīng)性進(jìn)化，高效選育FL耐受菌株

ALE：指在實(shí)驗(yàn)室條件下通過(guò)人為選擇壓力促使微生物（如聚球藻屬）逐步進(jìn)化獲得特定性狀（如高光耐受性）的研究方法。本研究中設(shè)計(jì)了FL0、FL +兩套方案，歷時(shí) 20 個(gè)月、20 輪培養(yǎng)，對(duì)聚球藻進(jìn)行了兩種波動(dòng)光方案下的ALE處理，過(guò)程依托 MC1000 8通道藻類培養(yǎng)與在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)高精度控制。

n 單克隆高通量初篩分型

對(duì)馴化的培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基并在恒定LL20光照條件下培養(yǎng)，隨后分離出單個(gè)克隆并培養(yǎng)，之后對(duì)單克隆菌落，利用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)進(jìn)行原位熒光成像，測(cè)定PSII 量子產(chǎn)率 Fv/Fm。依托該功能，從百余個(gè)克隆中篩選出覆蓋表型多樣性的通過(guò)對(duì)12株FL0和12株FL+單克隆菌株并進(jìn)行全基因組分析（以這些適應(yīng)性菌株的來(lái)源菌株LT以及原始可運(yùn)動(dòng)型集胞藻PCC 6803菌株[標(biāo)記為“WT”]作為對(duì)照），獲得了含412個(gè)突變的突變矩陣。大幅降低測(cè)序成本、提升篩選效率。

n 共有突變基因—Pam68功能鑒定

為驗(yàn)證基因功能，對(duì)Pam68過(guò)表達(dá)菌株（pam68oe），Pam68_S113G，pam68基因敲除突變體（ins0933）h在LL12和FL0final培養(yǎng)條件下進(jìn)行比較（下左圖）

為評(píng)估該S→G突變?cè)诓煌锓N中的適應(yīng)潛力，在集胞藻LT和ins0933菌株中分別表達(dá)了野生型AtPAM68（AtPAM68WT）和AtPAM68S174G，并在LL50、HL700及FL0final條件下觀察其生長(zhǎng)情況。（下右圖）

以上菌株的培養(yǎng)也在MC1000中完成，再次證明了這套系統(tǒng)在藻類全測(cè)量培養(yǎng)和研究階段的重要作用。

n 特異突變基因—rpaBT183P功能鑒定

   利用FluorCam葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)，對(duì)rpaBT183P突變菌株進(jìn)行非光化學(xué)熒光淬滅測(cè)量，以鑒定基因在光系統(tǒng)結(jié)構(gòu)功能方面的作用。結(jié)果表明rpaBT183P對(duì)光系統(tǒng)化學(xué)計(jì)量比及外周天線結(jié)構(gòu)的積累具有差異性影響：該基因通過(guò)下調(diào)藻膽體捕光容量、調(diào)控狀態(tài)轉(zhuǎn)換、重塑PSI/PSII化學(xué)計(jì)量比、提升CEF（環(huán)式電子傳遞）活性實(shí)現(xiàn)光保護(hù)，且存在低光生長(zhǎng)與強(qiáng)光耐受的權(quán)衡。

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