本生分享實(shí)驗(yàn)技巧：ELISA各個(gè)操作步驟的注意要點(diǎn)

　　ELISA實(shí)驗(yàn)每個(gè)步驟的注意要點(diǎn)，直接關(guān)系到實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本生BUNSEN小編分步驟整理如下：

　　一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

　　所有試劑提前從冷藏環(huán)境取出，?平衡至室溫(20-25℃)?再使用，避免低溫影響抗原抗體結(jié)合效率;未開封試劑需在2-8℃避光保存，標(biāo)準(zhǔn)品建議分裝凍存，避免反復(fù)凍融降解。本生BUNSEN試劑盒

　　實(shí)驗(yàn)前檢查移液器校準(zhǔn)情況，多通道移液器需逐孔校準(zhǔn)移液體積，避免移液誤差導(dǎo)致結(jié)果偏差。

　　提前確認(rèn)洗滌液濃度是否正確，若出現(xiàn)結(jié)晶需充分溶解混勻后再使用。

　　二、包被步驟

　　包被抗原/抗體需用?碳酸鹽緩沖液(pH9.6)?稀釋，濃度需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定，濃度過高會(huì)增加非特異性背景，過低會(huì)導(dǎo)致信號(hào)不足。

　　包被時(shí)保證每孔加液均勻，避免觸碰孔底刮傷包被面;包被后建議4℃?靜置過夜(12-16小時(shí))?，比37℃孵育結(jié)合更穩(wěn)定，背景更低。

　　包被完成后立即吸干孔內(nèi)液體，立刻加入封閉液，避免孔底干燥導(dǎo)致封閉不均。

　　三、封閉步驟

　　封閉液選擇需匹配實(shí)驗(yàn)體系：一般檢測(cè)用5%脫脂奶粉，磷酸化蛋白檢測(cè)推薦用1% BSA(脫脂奶粉含磷酸化酶會(huì)干擾結(jié)果)。

　　封閉時(shí)間至少1-2小時(shí)，推薦室溫封閉，避免4℃封閉時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致包被物脫落;封閉后充分洗滌3次，去除未結(jié)合的封閉蛋白。

　　四、加樣步驟

　　加樣時(shí)槍頭不要觸碰孔壁和孔底，避免戳掉包被物;每加完一個(gè)樣本更換一次槍頭，避免交叉污染。

　　加樣速度保持均勻，避免液體濺出或產(chǎn)生氣泡，若出現(xiàn)氣泡可輕輕用槍頭戳破，避免氣泡影響后續(xù)讀數(shù)。

　　樣本加樣后輕輕震動(dòng)酶標(biāo)板，確保樣本均勻覆蓋孔底，避免局部結(jié)合不均勻。

　　五、孵育步驟

　　孵育必須在?濕潤環(huán)境?中進(jìn)行，可在孵育盒底部墊濕潤濾紙，避免孔內(nèi)液體蒸發(fā)導(dǎo)致濃度偏差。

　　嚴(yán)格按照說明書控制孵育時(shí)間，不要隨意延長(zhǎng)，延長(zhǎng)會(huì)增加非特異性結(jié)合導(dǎo)致背景升高。

　　37℃孵育需密封孵育盒，避免冷凝水滴入孔內(nèi)，導(dǎo)致樣本濃度被稀釋。

　　六、洗滌步驟

　　洗滌是降低背景的核心步驟，每次洗滌需注滿每孔，浸泡30秒后再吸干，重復(fù)洗滌至少3-5次。

　　每次洗滌完成后，將酶標(biāo)板倒置在干凈吸水紙上用力拍干，去除孔內(nèi)殘留未結(jié)合物。

　　全自動(dòng)洗板機(jī)使用后需定期清理管道，避免殘留鹽分堵塞管道，導(dǎo)致洗滌不充分。

　　七、顯色步驟

　　底物溶液需現(xiàn)配現(xiàn)用，避光保存，避免提前氧化失效;加入底物時(shí)避免光照，顯色過程建議避光孵育。

　　顯色時(shí)間需通過預(yù)實(shí)驗(yàn)控制，不要過度顯色，當(dāng)陽性對(duì)照出現(xiàn)明顯顏色即可終止，過度顯色會(huì)升高背景。

　　加入底物后觀察顯色均勻性，如果出現(xiàn)不顯色斑塊，多是洗滌時(shí)刮傷包被面導(dǎo)致，實(shí)驗(yàn)結(jié)果需作廢。

　　八、終止與讀數(shù)

　　終止液加入順序和速度盡量和底物保持一致，確保每個(gè)孔終止反應(yīng)時(shí)間一致;終止后15分鐘內(nèi)必須完成讀數(shù)，超過時(shí)間產(chǎn)物會(huì)褪色，導(dǎo)致OD值偏低。

　　讀數(shù)前需擦干凈酶標(biāo)板底部，去除指紋、水漬，避免干擾透光率導(dǎo)致讀數(shù)誤差;設(shè)置雙波長(zhǎng)讀數(shù)(測(cè)量波長(zhǎng)+參比波長(zhǎng))，可有效降低背景噪音。

　　注：以上科研產(chǎn)品資料供參考，具體可咨詢技術(shù)老師!

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