大鼠胚胎成纖維細(xì)胞（Rat Embryonic Fibroblasts, REF）是從大鼠胚胎組織分離的原代貼壁細(xì)胞，廣泛用于滋養(yǎng)層制備、病毒包裝及細(xì)胞生物學(xué)研究。

一、基本特性

組織來(lái)源：大鼠胚胎（常用 E12–E15 天），屬間充質(zhì)來(lái)源。

形態(tài)：典型長(zhǎng)梭形/紡錘形，胞質(zhì)透明、核仁清晰，呈旋渦狀排列。

生長(zhǎng)：貼壁依賴(lài)，增殖快；3–7 代活性，一般可傳 10–12 代。

標(biāo)志物：高表達(dá)Vimentin、Fibronectin；陰性 CD34，陽(yáng)性 CD29/CD90。

功能：分泌膠原（I/III 型）、纖連蛋白等，支持干細(xì)胞生長(zhǎng)。

二、原代分離（胰酶 - 膠原酶消化法）

取材：無(wú)菌取孕鼠胚胎，PBS 洗去血污，去除頭/內(nèi)臟。

剪碎：組織剪成 1 mm3 小塊，PBS 漂洗 2–3 次。

消化：0.25% 胰酶 + 0.1% 膠原酶 Ⅰ，37℃消化 15–20 min，間斷吹打。

終止：加 10% FBS 滅活胰酶，離心（1200 rpm×5 min）。

純化：差速貼壁（30 min）去除雜細(xì)胞，收集成纖維細(xì)胞。

接種：DMEM+10% FBS + 雙抗，37℃、5% CO?培養(yǎng)。

三、常規(guī)培養(yǎng)體系

培養(yǎng)基：高糖 DMEM + 10% FBS + 1% 雙抗（青霉素/鏈霉素）。

培養(yǎng)條件：37℃、5% CO?、飽和濕度。

換液：每 2–3 天半量換液。

傳代：匯合度 80%–90% 時(shí)，0.25% 胰酶消化，按 1:3–1:5 分瓶。

凍存：90% FBS + 10% DMSO，梯度降溫后液氮保存。

四、主要應(yīng)用

干細(xì)胞滋養(yǎng)層：支持胚胎干細(xì)胞（ESC）/誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSC）的增殖與干性維持。

病毒包裝：常用于慢病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒的包裝與擴(kuò)增。

細(xì)胞模型：研究增殖、凋亡、衰老及信號(hào)通路；組織工程（人工皮膚、軟骨）。

藥物與毒理：藥物篩選、毒性評(píng)估及傷口愈合機(jī)制研究。

五、常見(jiàn)問(wèn)題與注意事項(xiàng)

污染防控：全程無(wú)菌操作，培養(yǎng)基加雙抗；定期檢測(cè)支原體。

狀態(tài)把控：3–7 代用于實(shí)驗(yàn)；避免過(guò)度消化或血清批次差異。

分化風(fēng)險(xiǎn)：長(zhǎng)期培養(yǎng)易自發(fā)分化，需嚴(yán)格控制傳代次數(shù)。

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