百歐博偉生物：食品微生物檢測中，稀釋平板計(jì)數(shù)法主要用于定量分析食品中細(xì)菌總數(shù)、霉菌酵母菌總數(shù)、致病菌（如大腸桿菌、沙門氏菌）活菌數(shù)，核心是通過樣品均質(zhì)化、梯度稀釋、傾注平板等步驟，實(shí)現(xiàn)單菌落分離與計(jì)數(shù)，確保結(jié)果符合食品衛(wèi)生國標(biāo)。以下是結(jié)合食品樣品特性的詳細(xì)可執(zhí)行操作流程，含樣品預(yù)處理、稀釋、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)全環(huán)節(jié)，兼顧安全性與準(zhǔn)確性：

一、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備（符合食品檢測無菌要求）

1、器材與試劑準(zhǔn)備

（1）無菌器材

核心器材：無菌均質(zhì)袋（或均質(zhì)杯）、15mL 無菌試管、9cm 無菌培養(yǎng)皿、1mL/10mL 無菌移液管、移液器（10~1000μL）、無菌剪刀/鑷子、酒精燈、試管架、培養(yǎng)皿架。

輔助器材：高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺、恒溫培養(yǎng)箱（37℃/28℃）、漩渦振蕩器、均質(zhì)器（拍打式/旋轉(zhuǎn)式）、電子天平（精度 0.1g）、冰箱（4℃）。

（2）試劑與培養(yǎng)基

稀釋液：0.85% 無菌生理鹽水（維持細(xì)菌滲透壓，避免細(xì)胞破裂），需高壓滅菌（121℃，15min），冷卻后 4℃?zhèn)溆茫ㄓ行?7 天）。

培養(yǎng)基（按檢測目標(biāo)選擇，均需滅菌）：

細(xì)菌總數(shù)計(jì)數(shù)：營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（NA，37℃培養(yǎng)）；

霉菌酵母菌總數(shù)：孟加拉紅瓊脂培養(yǎng)基（或馬鈴薯葡萄糖瓊脂 PDA，28℃培養(yǎng)）；

大腸桿菌計(jì)數(shù)：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（鑒別性，37℃培養(yǎng)）；

沙門氏菌計(jì)數(shù)：SS 瓊脂培養(yǎng)基（選擇性，37℃培養(yǎng)）。

其他：75% 酒精、無菌棉片、樣品標(biāo)簽。

（3）環(huán)境與人員準(zhǔn)備

超凈工作臺：紫外線消毒 30min，開啟通風(fēng)扇 5~10min（排除臭氧），臺面用 75% 酒精擦拭消毒。

人員：穿戴無菌工作服、手套、口罩、帽子，雙手用 75% 酒精消毒，避免頭發(fā)、衣物接觸樣品和器材。

二、樣品預(yù)處理（食品樣品均質(zhì)化，關(guān)鍵步）

食品樣品（固體/半固體/液體）需先制成均勻懸液，避免局部濃度不均導(dǎo)致計(jì)數(shù)，按樣品類型操作：

1、固體食品（如肉類、糕點(diǎn)、蔬菜、堅(jiān)果）

樣品取樣：按國標(biāo)要求隨機(jī)取樣（如肉類取 25g，糕點(diǎn)取 25g），用無菌剪刀剪碎（避免交叉污染，剪刀需灼燒冷卻），放入無菌均質(zhì)袋中。

加入稀釋液：在均質(zhì)袋中加入 225mL 無菌生理鹽水（形成 1:10 的初始稀釋液，即 10?1），密封均質(zhì)袋。

均質(zhì)處理：將均質(zhì)袋放入拍打式均質(zhì)器中，拍打 1~2min（速度 100~150 次 /min），使樣品與稀釋液充分混合，制成均勻懸液（若均質(zhì)器，可用無菌玻璃棒攪拌 5min，靜置 1min 待雜質(zhì)沉降）。

2、半固體食品（如酸奶、果醬、醬料）

取樣 25g，放入無菌均質(zhì)杯（或均質(zhì)袋）中，加入 225mL 無菌生理鹽水（1:10 稀釋，10?1）。

用均質(zhì)器攪拌 3~5min（或手動攪拌至無顆粒），確保樣品溶解，避免結(jié)塊（如酸奶需攪拌至無凝塊，果醬需打散顆粒）。

3、液體食品（如飲料、飲用水、醬油）

取樣 25mL，直接注入含 225mL 無菌生理鹽水的無菌錐形瓶中（1:10 稀釋，10?1），若樣品黏稠，需先加入少量無菌生理鹽水稀釋后再定容至 225mL。

用漩渦振蕩器振蕩 1min，或顛倒錐形瓶 10 次，充分混勻。

4、特殊食品（含防腐劑/高鹽/高糖食品）

如泡菜、咸菜（高鹽）：用無菌 PBS 緩沖液替代生理鹽水（避免高鹽疊加導(dǎo)致細(xì)菌死亡）；

如果汁、飲料（含防腐劑）：適當(dāng)增加稀釋倍數(shù)（如直接 1:100 稀釋），減少防腐劑對微生物的抑制作用。

關(guān)鍵注意：

樣品預(yù)處理需在采樣后 2h 內(nèi)完成，若無法及時(shí)檢測，需 4℃冷藏（不超過 24h），避免微生物死亡或增殖；

均質(zhì)過程避免樣品濺出，均質(zhì)袋/杯需保持無菌，操作后用酒精擦拭均質(zhì)器表面消毒。

三、梯度稀釋（10 倍系列稀釋，控制濃度范圍）

基于食品微生物污染程度調(diào)整稀釋梯度（常規(guī)食品選擇 10?1~10??，高污染食品如變質(zhì)肉類可延伸至 10??，低污染食品如瓶裝水可至 10?3），操作如下：

試管標(biāo)記：取 5 支無菌試管，依次標(biāo)記 “10?2、10?3、10??、10??、10??”，每管加入 9mL 無菌生理鹽水。

系列稀釋：

用無菌移液管吸取 10?1 稀釋液（均質(zhì)后的懸液）1mL，在酒精燈火焰旁緩慢注入 10?2 試管中（移液管貼壁，避免濺出）。

蓋緊試管蓋，用漩渦振蕩器振蕩 1min（或手捏試管顛倒 15 次），充分混勻，靜置 1min（氣泡消散）。

更換新的無菌移液管，從 10?2 試管中吸取 1mL 稀釋液，注入 10?3 試管中，振蕩混勻；依次類推，完成 10?2~10??稀釋（每一步必須更換移液管，避免交叉污染）。

稀釋要點(diǎn)：

移液時(shí)吸量準(zhǔn)確（1mL ≤0.05mL），避免稀釋倍數(shù)偏差；

高污染食品可在 10??后增加 10??稀釋（額外加 1 支 9mL 試管），低污染食品（如無菌飲用水）可只做 10?1~10?3 稀釋。

四、傾注平板與接種（確保菌落均勻分離）

培養(yǎng)皿標(biāo)記：取每個(gè)目標(biāo)稀釋度（如 10?3、10??、10??、10??）3 個(gè)無菌培養(yǎng)皿，清晰標(biāo)記樣品名稱、稀釋度、檢測項(xiàng)目（如“豬肉 - 10??- 細(xì)菌總數(shù)”）、日期、操作者。

培養(yǎng)基準(zhǔn)備：將滅菌后的固體培養(yǎng)基（如營養(yǎng)瓊脂）放入沸水浴或微波爐中融化，冷卻至 45~50℃（手感不燙手，滴在手腕內(nèi)側(cè)無刺痛感），避免溫度過高殺死細(xì)菌，過低導(dǎo)致培養(yǎng)基凝固。

接種菌液：

用無菌移液管吸取 0.1mL（或 1mL）對應(yīng)稀釋度的菌液，滴加到培養(yǎng)皿（滴加時(shí)移液管靠近皿底，避免濺出）；

建議接種體積：高污染食品用 0.1mL（避免菌落過多），低污染食品用 1mL（提高檢出率），同一批樣品接種體積需統(tǒng)一。

傾注與混勻：

迅速將冷卻至 45℃的培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿中，每皿 15~20mL（剛好覆蓋皿底，厚度均勻）；

立即輕輕旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)皿（順時(shí)針 + 逆時(shí)針各 3 圈，幅度不宜過大），使菌液與培養(yǎng)基充分混合（避免菌液聚集在導(dǎo)致菌落重疊）；

若培養(yǎng)基中產(chǎn)生氣泡，輕輕敲擊培養(yǎng)皿邊緣排出（氣泡會遮擋菌落或?qū)е滦螒B(tài)異常）。

凝固：將培養(yǎng)皿平放在超凈工作臺中，開蓋通風(fēng) 1~2min（去除冷凝水），蓋緊蓋子后倒置放置，待培養(yǎng)基凝固（約 15~20min，觸摸皿底無粘膩感）。

五、培養(yǎng)（按微生物類型控制條件，符合國標(biāo)要求）

將凝固后的培養(yǎng)皿放入恒溫培養(yǎng)箱中，按檢測目標(biāo)設(shè)置培養(yǎng)條件，避免溫度/時(shí)間偏差影響菌落生長：

檢測項(xiàng)目        培養(yǎng)基類型     培養(yǎng)溫度   培養(yǎng)時(shí)間   備注

細(xì)菌總數(shù)        營養(yǎng)瓊脂（NA）  37℃  48h±2h  有氧培養(yǎng)，適用于大多數(shù)細(xì)菌

霉菌酵母菌總數(shù)  孟加拉紅瓊脂    28℃  72h±2h  有氧培養(yǎng)，避免光照直射

大腸桿菌計(jì)數(shù)    麥康凱瓊脂      37℃  24h±2h  鑒別性培養(yǎng)，菌落呈紅色

沙門氏菌計(jì)數(shù)    SS 瓊脂         37℃  24~48h   選擇性培養(yǎng)，菌落呈無色透明

關(guān)鍵注意：

培養(yǎng)時(shí)培養(yǎng)皿需倒置（避免冷凝水滴落污染菌落或?qū)е戮鋽U(kuò)散）；

霉菌酵母菌培養(yǎng)期間需保持培養(yǎng)箱內(nèi)濕度（可放一杯無菌水），避免培養(yǎng)基干裂；

嚴(yán)格遵守培養(yǎng)時(shí)間，不足會導(dǎo)致菌落過小無法計(jì)數(shù)，過長會導(dǎo)致菌落重疊或雜菌過度生長。

六、菌落計(jì)數(shù)與結(jié)果計(jì)算（按國標(biāo)規(guī)范統(tǒng)計(jì)）

1、菌落觀察與篩選

培養(yǎng)結(jié)束后，取出培養(yǎng)皿，肉眼觀察菌落形態(tài)（如細(xì)菌菌落呈圓形、邊緣清晰，霉菌菌落呈絨毛狀、有顏色），排除雜菌（若出現(xiàn)與目標(biāo)菌落形態(tài)差異極大的菌落，需排查污染原因）。

選擇菌落數(shù)在 30~300 之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)（國標(biāo)規(guī)定該范圍統(tǒng)計(jì)結(jié)果最準(zhǔn)確，低于 30 率＞10%，高于 300 菌落重疊無法區(qū)分）。

2、計(jì)數(shù)方法

肉眼計(jì)數(shù)：用記號筆標(biāo)記已計(jì)數(shù)的單菌落，避免漏數(shù)或重復(fù)計(jì)數(shù)；

輔助工具：用菌落計(jì)數(shù)器或放大鏡輔助計(jì)數(shù)，尤其適用于微小菌落、透明菌落；

特殊情況處理：

鏈狀生長的細(xì)菌（如鏈球菌）：單鏈≤3 個(gè)細(xì)胞按 1 個(gè)菌落計(jì)數(shù)，＞3 個(gè)細(xì)胞需注明計(jì)數(shù)方式；

霉菌菌落：若菌絲蔓延，按“單個(gè)菌落形成單位”統(tǒng)計(jì)（即使菌絲相連，若源自單個(gè)孢子/菌絲片段，按 1 個(gè)計(jì)數(shù)）。

3、異常平板處理

同一稀釋度 3 個(gè)平板的菌落數(shù)差異過大（超出平均值的 ±20%），需剔除異常平板（如污染、菌落重疊嚴(yán)重）后重新計(jì)算平均值；若無法剔除，需重新實(shí)驗(yàn)；

所有稀釋度平板菌落數(shù)均＜30：結(jié)果報(bào)告為“＜30 CFU/g（mL）”（需注明稀釋倍數(shù)）；

所有稀釋度平板菌落數(shù)均＞300：結(jié)果報(bào)告為“＞300 CFU/g（mL）”（或增加稀釋倍數(shù)重新實(shí)驗(yàn)）；

空白對照：設(shè)置“無菌生理鹽水 + 培養(yǎng)基”的空白平板，同條件培養(yǎng)后若出現(xiàn)菌落，說明器材、試劑或操作污染，需重新實(shí)驗(yàn)。

4、結(jié)果計(jì)算

核心公式（按國標(biāo)推導(dǎo)）：

每克（毫升）樣品中微生物數(shù)（CFU/g/mL）= 平均菌落數(shù) × 稀釋倍數(shù) ÷ 接種體積（mL）

示例：

檢測豬肉中細(xì)菌總數(shù)，10??稀釋度的 3 個(gè)平板菌落數(shù)分別為 52、48、55，接種體積 0.1mL：

平均菌落數(shù) =（52+48+55）/3 = 51.67 ≈ 52；

稀釋倍數(shù) = 10?（10?1 初始稀釋 + 10?2~10??梯度稀釋，總稀釋倍數(shù)為 10?）；

原始濃度 = 52 × 10? ÷ 0.1 = 5.2×10? CFU/g。

單位規(guī)范：

固體食品單位為 “CFU/g”，液體食品為 “CFU/mL”，不可簡寫為 “個(gè) /g（mL）”；

結(jié)果保留 1~2 位有效數(shù)字，用科學(xué)計(jì)數(shù)法表示（如 5.2×10? CFU/g，而非 5200000 CFU/g）。

七、實(shí)驗(yàn)后處理與記錄（符合檢測規(guī)范）

1、廢棄物處理

培養(yǎng)后的含菌平板、試管、移液管等需放入高壓蒸汽滅菌鍋（121℃，30min）滅菌后，再按醫(yī)療廢棄物處理，避免微生物污染環(huán)境；

超凈工作臺臺面用 75% 酒精擦拭消毒，均質(zhì)器、移液器等器材清潔后紫外線消毒 30min。

2、結(jié)果記錄與報(bào)告

按食品檢測報(bào)告格式記錄以下信息，確保數(shù)據(jù)可追溯：

樣品信息：樣品名稱、批號、生產(chǎn)廠家、取樣時(shí)間、取樣地點(diǎn)；

實(shí)驗(yàn)信息：稀釋梯度設(shè)置、各平板菌落數(shù)、平均菌落數(shù)、接種體積、稀釋倍數(shù)、原始濃度；

培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基類型、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)時(shí)間、氣體環(huán)境；

質(zhì)量控制：空白對照結(jié)果、平行樣誤差情況；

結(jié)果判定：是否符合對應(yīng)的食品衛(wèi)生國標(biāo)（如 GB 2726-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 熟肉制品》規(guī)定，熟肉制品細(xì)菌總數(shù)≤8×10? CFU/g）。

八、食品檢測專屬注意事項(xiàng)（避免國標(biāo)不符）

樣品代表性：嚴(yán)格按國標(biāo)取樣（如隨機(jī)取樣、多點(diǎn)取樣），避免取污染嚴(yán)重或未污染的局部樣品，導(dǎo)致結(jié)果失真；

無菌操作強(qiáng)化：食品樣品易攜帶雜菌，所有操作需在超凈工作臺酒精燈火焰旁進(jìn)行，培養(yǎng)皿開蓋時(shí)間≤10s，移液管、剪刀等器材使用前后需灼燒滅菌；

稀釋液選擇：高鹽/高糖/酸性食品（如泡菜、蜂蜜、果汁）需用無菌 PBS 緩沖液或中性稀釋液，避免滲透壓或 pH 沖擊導(dǎo)致細(xì)菌死亡；

培養(yǎng)基適配：致病菌計(jì)數(shù)必須使用選擇性/鑒別培養(yǎng)基（如大腸桿菌用麥康凱瓊脂、沙門氏菌用 SS 瓊脂），避免雜菌干擾計(jì)數(shù)；

國標(biāo)合規(guī)性：所有操作（如取樣量、稀釋倍數(shù)、培養(yǎng)條件、計(jì)數(shù)范圍）需符合對應(yīng)的食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)（如 GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 細(xì)菌總數(shù)測定》），確保結(jié)果具有法律效力。

總結(jié)

稀釋平板計(jì)數(shù)法在食品微生物檢測中的核心是“樣品均質(zhì)化 + 無菌操作 + 國標(biāo)化培養(yǎng) + 規(guī)范計(jì)數(shù)”，需針對食品類型（固體/液體/特殊食品）調(diào)整預(yù)處理和稀釋方案，同時(shí)嚴(yán)格遵循國標(biāo)要求控制培養(yǎng)條件和計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)。該方法能直觀反映食品中活菌污染水平，是食品生產(chǎn)企業(yè)質(zhì)量控制、市場監(jiān)管部門監(jiān)督抽檢的核心技術(shù)，實(shí)操中需重點(diǎn)關(guān)注樣品代表性、稀釋準(zhǔn)確性和無菌控制，避免因操作偏差導(dǎo)致結(jié)果不合格或誤判。

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