引言

體外毒理學(xué)研究結(jié)果的可靠性和可重復(fù)性，很大程度上取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷倪x擇。不同細(xì)胞類型、暴露方式、劑量和時(shí)間，可能導(dǎo)致截然不同的結(jié)論。這篇綜述匯總了23項(xiàng)研究的方法學(xué)數(shù)據(jù)，為后續(xù)研究者提供了一個(gè)實(shí)用的“方法工具箱”。

一、細(xì)胞類型的選擇：各有何優(yōu)劣？

1. 腫瘤來源細(xì)胞系：A549

• 使用頻次：7項(xiàng)研究。

• 特點(diǎn)：來源于人肺泡基底上皮癌，易于培養(yǎng)，可重復(fù)性好。

• 重要局限：A549攜帶K-Ras突變，導(dǎo)致Nrf2結(jié)構(gòu)性高活性。由于Nrf2是抗氧化反應(yīng)的核心轉(zhuǎn)錄因子，高活性Nrf2會(huì)使A549對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性低于正常上皮細(xì)胞，可能低估某些煙霧的毒性。因此，使用A549獲得的陰性結(jié)果需謹(jǐn)慎解讀。

2. 永生化細(xì)胞系：BEAS-2B、16-HBE

• 使用頻次：8項(xiàng)研究。

• 特點(diǎn)：分別通過SV40病毒轉(zhuǎn)化或HPV E6/E7基因轉(zhuǎn)染獲得，來源于正常人支氣管上皮。它們保留了大部分分化特征，且對(duì)氧化應(yīng)激的反應(yīng)與正常細(xì)胞接近，被認(rèn)為是平衡可重復(fù)性與生理相關(guān)性的較好選擇。

3. 原代細(xì)胞：pHBEC、HBEC、SAEC、HLBEC、hNEC等

• 使用頻次：12項(xiàng)研究（最多的一類）。

• 特點(diǎn)：直接來自人體（通常為手術(shù)切除或支氣管刷檢），最貼近體內(nèi)狀態(tài)。但存在個(gè)體差異、代數(shù)有限、培養(yǎng)技術(shù)要求高、成本昂貴等挑戰(zhàn)。

• 典型應(yīng)用：Tassew et al. (2022) 使用來自Lovelace吸煙者隊(duì)列的鼻刷檢細(xì)胞，研究p53基因多態(tài)性對(duì)野火煙霧誘導(dǎo)MUC5AC表達(dá)的影響。

4. 其他特殊細(xì)胞

• 肺泡Ⅱ型細(xì)胞：如AALE，用于研究表面活性蛋白變化。

• 鼻上皮細(xì)胞（hNEC）：用于上呼吸道反應(yīng)研究。

綜述建議：如果目標(biāo)是機(jī)制篩選和高通量測(cè)試，永生化細(xì)胞系（BEAS-2B）是合理選擇；如果目標(biāo)是評(píng)估與人類疾病的相關(guān)性，應(yīng)優(yōu)先考慮原代細(xì)胞；而A549適用于對(duì)Nrf2通路不敏感的研究方向，但應(yīng)報(bào)告其Nrf2活性狀態(tài)。

二、暴露方式：浸沒式 vs. 氣-液界面（ALI）

浸沒式暴露

• 操作：將顆粒物提取或懸浮在培養(yǎng)基中，直接加到細(xì)胞上。

• 優(yōu)點(diǎn)：簡(jiǎn)便、快速、成本低、易于高通量。

• 缺點(diǎn)：無法模擬吸入條件下“空氣從頂端接觸細(xì)胞”的生理狀態(tài)；顆粒物可能沉降在培養(yǎng)基中，與細(xì)胞的相互作用受擴(kuò)散和沉降動(dòng)力學(xué)影響；水溶性氣體成分會(huì)損失。

• 使用比例：23項(xiàng)中約占74%（以浸沒式為主或僅用浸沒式）。

ALI暴露

• 操作：細(xì)胞生長(zhǎng)在Transwell膜上，頂端面暴露于空氣或煙霧氣流，基底側(cè)面接觸培養(yǎng)基。

• 優(yōu)點(diǎn)：更貼近體內(nèi)氣道上皮的極性結(jié)構(gòu)和暴露方式；可同時(shí)模擬氣態(tài)和顆粒態(tài)暴露；適用于黏液分泌、纖毛擺動(dòng)等功能研究。

• 缺點(diǎn)：設(shè)備復(fù)雜、成本高、通量低。

• 使用比例：約26%（包括部分同時(shí)使用兩種方法的研究）。

代表性ALI研究：

• Abzhanova et al. (2024) 在pHBEC-ALI中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)氧化還原變化。

• Colvin et al. (2024) 在HBEC-ALI中暴露于PAH混合物，同時(shí)測(cè)量LDH和TEER。

• Nguyen et al. (2023) 在AALE-ALI中暴露于野火煙霧，分析lncRNA表達(dá)譜。

建議：如果研究重點(diǎn)關(guān)注氣溶膠的直接作用（如野火煙霧），ALI是更符合生理的選擇；如果僅需初步篩選顆粒物的細(xì)胞毒性，浸沒式仍可接受，但需注意結(jié)果的生理外推性受限。

三、暴露濃度與持續(xù)時(shí)間

濃度

• 液體暴露中，PM濃度范圍：1–100 µg/cm2（或µg/mL）。

• 空氣暴露中，PM濃度：3–500 mg/m3不等。

• 少數(shù)研究使用“% w/v”形式的煙霧浸泡液（如5%、10%）。

• 綜述指出，沉積模型估算：100 µg/mL的體外濃度約相當(dāng)于在100-150 µg/m3環(huán)境空氣中吸入24小時(shí)后肺部的沉積量，因此該濃度范圍具有現(xiàn)實(shí)意義。

時(shí)間

• 急性/超急性（15分鐘 – 6小時(shí)）：多用于檢測(cè)ROS、MAPK磷酸化、早期基因表達(dá)（如CYP1A1可在30分鐘內(nèi)上調(diào)）。

• 亞急性（12 – 48小時(shí)）：最常見的是24小時(shí)，用于細(xì)胞活力、LDH、細(xì)胞因子、DNA損傷。

• 長(zhǎng)期（>48小時(shí)）：極少見，僅有極少數(shù)研究延長(zhǎng)至72小時(shí)或3個(gè)月。

劑量-反應(yīng)關(guān)系

• 61%（14/23）的研究使用了至少3個(gè)濃度點(diǎn)，進(jìn)行了劑量-反應(yīng)分析。

• 多數(shù)效應(yīng)（細(xì)胞因子釋放、DNA損傷、活力下降）呈濃度依賴性。

四、檢測(cè)終點(diǎn)與常用技術(shù)

五、共培養(yǎng)系統(tǒng)及其他模型

• A549 + THP-1：用于研究上皮-免疫細(xì)胞交互（Bolling et al., 2012）。

• 肺切片：少數(shù)研究使用精密切割肺切片，保留組織結(jié)構(gòu)。

• 3D培養(yǎng)：尚未廣泛使用，但未來值得探索。

總結(jié)：沒有的單一模型。研究者應(yīng)根據(jù)科學(xué)問題、預(yù)算和實(shí)驗(yàn)室條件做出權(quán)衡。對(duì)于希望開展標(biāo)準(zhǔn)化煙霧暴露實(shí)驗(yàn)的團(tuán)隊(duì)，采用商業(yè)化的ALI暴露系統(tǒng)（如CULTEX®或同類產(chǎn)品）配合永生化或原代人支氣管上皮細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置至少3個(gè)濃度點(diǎn)和多個(gè)時(shí)間點(diǎn)，是目前較為的“金標(biāo)準(zhǔn)”框架。

• 對(duì)于普通公眾：野火期間減少戶外活動(dòng)、使用空氣凈化器、佩戴N95口罩，是切實(shí)可行的自我保護(hù)措施。

• 對(duì)于科研人員：開展木材/野火煙霧毒性研究時(shí)，應(yīng)關(guān)注燃燒條件的標(biāo)準(zhǔn)化、細(xì)胞模型的選擇以及暴露方式（推薦ALI）。同時(shí)，可借助商業(yè)化的香煙煙霧，實(shí)現(xiàn)可重復(fù)、標(biāo)準(zhǔn)化的暴露實(shí)驗(yàn)，加速機(jī)制研究與防護(hù)策略開發(fā)。

在進(jìn)行木材/野火煙霧的體外暴露實(shí)驗(yàn)時(shí)，穩(wěn)定、可重復(fù)的氣溶膠發(fā)生與暴露系統(tǒng)是關(guān)鍵。

香煙煙霧細(xì)胞暴露系統(tǒng)Aexpo 由德伯科技（Databiosci）自主研發(fā)，依據(jù)ISO3308與CIR國(guó)際吸煙標(biāo)準(zhǔn)設(shè)計(jì)，適用于體外氣液界面（ALI）條件下的細(xì)胞吸入暴露與毒理研究。系統(tǒng)集成高精度ISO3308/CIR香煙煙霧發(fā)生器與自動(dòng)吸煙機(jī)，可實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定、可重復(fù)的煙氣生成與傳輸。

通過6個(gè)通道輻射流氣液界面暴露模塊，裝置可對(duì)6個(gè)細(xì)胞小室進(jìn)行染毒實(shí)驗(yàn)，支持濃度梯度、動(dòng)態(tài)稀釋及實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，確保實(shí)驗(yàn)的可控性與可追溯性。該系統(tǒng)廣泛應(yīng)用于煙霧毒理、電煙及顆粒物吸入研究，為吸入毒理學(xué)和呼吸系統(tǒng)細(xì)胞模型研究提供標(biāo)準(zhǔn)化解決方案。

這類設(shè)備不僅適用于電煙研究，也可用于木材、生物質(zhì)燃燒煙霧的體外毒理學(xué)評(píng)估，為研究者提供標(biāo)準(zhǔn)化、高重復(fù)性的實(shí)驗(yàn)工具，加速野火/木材煙霧健康風(fēng)險(xiǎn)研究的進(jìn)展。

文獻(xiàn)來源：Heibati, B., Renz, H., & Lacy, P. (2025). Wildlife and wood smoke effects on human airway epithelial cells: A scoping review. Journal of Hazardous Materials