摘要： 在皮膚光老化及防曬化妝品原料體外評(píng)價(jià)中，建立穩(wěn)定、可重復(fù)的UVB誘導(dǎo)表皮細(xì)胞損傷模型是關(guān)鍵前提。本文介紹了利用LUYOR-3200 紫外交聯(lián)儀（UVB, λmax=302 nm）對(duì)HaCaT人永生化表皮細(xì)胞進(jìn)行定量UVB照射的實(shí)驗(yàn)方法，并與傳統(tǒng)UV燈箱進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證了該儀器在劑量控制、均勻性及實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)性方面的優(yōu)勢(shì)。

1. 引言

UVB（290–320 nm）是中波紫外線，能引起皮膚紅斑、DNA損傷及細(xì)胞凋亡，是構(gòu)建體外皮膚光損傷模型的主要誘導(dǎo)因素。傳統(tǒng)開(kāi)放式UVB燈箱通常依靠計(jì)時(shí)控制照射時(shí)間，受燈管老化、電壓波動(dòng)影響大，導(dǎo)致不同批次間照射劑量差異顯著，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重現(xiàn)性差。

LUYOR-3200 紫外交聯(lián)儀內(nèi)置UVB傳感器，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)累積輻照能量，自動(dòng)在達(dá)到設(shè)定劑量（mJ/cm2）時(shí)切斷光源，從而實(shí)現(xiàn)真正意義上的"能量控制"而非"時(shí)間控制"。

2. 材料與儀器

3. 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞接種

將HaCaT細(xì)胞接種于6孔或12孔細(xì)胞培養(yǎng)板，37℃、5% CO?培養(yǎng)至融合度70%~80%。

3.2 UVB照射操作

1. 吸除原培養(yǎng)液，每孔加入預(yù)溫HBSS（薄層覆蓋，約0.5~1 mL/孔），避免PBS蒸發(fā)及細(xì)胞干燥。

   
   

2. 將培養(yǎng)板水平放入LUYOR-3200照射腔，關(guān)閉艙門。

   
   

3. 在控制面板上設(shè)定照射劑量：

   
   

• 預(yù)實(shí)驗(yàn)劑量：10 mJ/cm2（輕度損傷）

  
  

• 常規(guī)造模劑量：20~30 mJ/cm2（中度損傷，常用于抗氧化評(píng)價(jià)）

  
  

4. 按"Start"，儀器自動(dòng)累計(jì)能量，達(dá)到設(shè)定值后蜂鳴提示并自動(dòng)關(guān)斷UVB光源。

   
   

5. 吸除HBSS，更換為培養(yǎng)基（含或不含受試提取物），繼續(xù)培養(yǎng)6 h、24 h或48 h后檢測(cè)。

   
   

注意：照射全過(guò)程建議在超凈臺(tái)暗室或避強(qiáng)光環(huán)境下進(jìn)行，減少可見(jiàn)光對(duì)光敏反應(yīng)的影響。

3.3 檢測(cè)指標(biāo)

• 細(xì)胞活力：CCK-8法，450 nm測(cè)定吸光度

  
  

• 胞內(nèi)ROS：DCFH-DA探針，熒光酶標(biāo)儀（Ex 488 nm / Em 525 nm）

  
  

• 細(xì)胞凋亡：Annexin V-FITC/PI雙染，流式細(xì)胞術(shù)

  
  

• DNA損傷：γH2AX免疫熒光或Western Blot

  
  

• 凋亡/自噬相關(guān)蛋白：Caspase-3、Bax/Bcl-2、LC3-I/II、p62

  
  

4. 結(jié)果與討論

4.1 劑量-效應(yīng)關(guān)系

經(jīng)LUYOR-3200照射后，HaCaT細(xì)胞呈現(xiàn)典型的UVB劑量依賴性損傷：

• 10 mJ/cm2：ROS輕度升高，細(xì)胞活力無(wú)明顯下降

  
  

• 20~30 mJ/cm2：ROS顯著升高（P<0.01），凋亡率增加，γH2AX foci明顯

  
  

• 50 mJ/cm2：大面積壞死，不適合做藥物保護(hù)模型

  
  

4.2 與常規(guī)UVB燈箱對(duì)比

4.3 模型驗(yàn)證

以梔子果提取物（GFE）或卷柏提取物（STE）為保護(hù)性受試物，預(yù)處理后經(jīng)LUYOR-3200造模，結(jié)果顯示ROS水平降低、Caspase-3活化受抑、LC3-II/I比值升高，提示模型可用于天然產(chǎn)物光保護(hù)作用評(píng)價(jià)。

5. 結(jié)論

LUYOR-3200 紫外交聯(lián)儀通過(guò)精確的UVB能量控制，可有效克服傳統(tǒng)燈箱劑量不確定的缺陷，適用于：

• 皮膚光老化/光毒性體外模型構(gòu)建

  
  

• 化妝品及天然產(chǎn)物防曬/抗氧化功效初篩

  
  

• 細(xì)胞光生物學(xué)基礎(chǔ)研究中UVB劑量-效應(yīng)關(guān)系研究

  
  

建議在建立UVB細(xì)胞模型時(shí)，優(yōu)先采用能量設(shè)定模式（mJ/cm2），并在論文"Materials and Methods"中明確標(biāo)注儀器型號(hào)及照射劑量

此文提供參考，若需原文獻(xiàn)可以聯(lián)系后臺(tái)工作人員