基礎參數(shù)參考：

PAMAM G5-NH2：分子量～28826 Da，分子直徑～8.6 nm，表面氨基數(shù) 128 個，內(nèi)部疏水空腔發(fā)達，水溶性佳；游離氨基帶正電，可同時做修飾、偶聯(lián)、靜電復合。

一、前期準備（試劑、耗材、基礎溶液）

1. 核心原料

• PAMAM G5（氨基端，G5-NH?）

• 目標藥物：以阿霉素 DOX、紫杉醇 PTX、姜黃素 CUR、喜樹堿 CPT四類經(jīng)典疏水藥物為例

• 輔料：DMSO、甲醇、乙醇、PBS 緩沖液（pH 7.4 /pH 5.0）、透析袋（截留分子量 MWCO：3500 / 8000 Da）

• 活化試劑（共價偶聯(lián)用）：EDC?HCl、NHS、三乙胺、冰醋酸

2. 預處理

1. PAMAM G5 配制成 1 mg/mL 水溶液，4℃避光保存；

2. 疏水藥物先用少量 DMSO 配成 10 mM 母液（DMSO 終濃度控制＜5%，避免細胞毒性）；

3. 所有溶液過 0.22 μm 水系濾膜除菌。

方案一：物理包埋載藥（內(nèi)部空腔包合，常用、操作簡單）

適用場景

1. 投料配比（優(yōu)化比例，載藥量最高）

2. 合成步驟

1. 取 10 mL 1 mg/mL G5-NH? 水溶液置于圓底瓶，室溫磁力攪拌（300 rpm）；

2. 逐滴加入藥物 - DMSO 母液，滴加時間 ≥30 min，避免局部濃度過高團聚；

3. 室溫避光攪拌 12~24 h（攪拌越充分，包封率越高）；

4. 純化：裝入透析袋（MWCO 8000 Da），用超純水透析 24 h，每 6 h 換水，去除游離未包合藥物與 DMSO；

5. 透析結束后，溶液過 0.22 μm 濾膜，得到 G5@藥物 包合物，4℃避光儲存。

3. 關鍵指標計算（包封率 EE、載藥量 LC）

• 阿霉素 (DOX)：EE ≈ 75%~85%，LC ≈ 8%~12%

• 紫杉醇 (PTX)：EE ≈ 65%~78%，LC ≈ 6%~10%

4. 藥物體外釋放（pH 響應模型）

1. 取 5 mL G5@藥物溶液裝入透析袋，置于 40 mL 釋放介質(zhì)（PBS pH7.4 /pH5.0）；

2. 37℃、低速攪拌，定時取樣（1、2、4、8、12、24、48 h），補加同溫度新鮮緩沖液；

3. UV 測定吸光度，計算累計釋藥率。

• pH 7.4（正常環(huán)境）：緩慢釋放，24 h 累計釋放 20%~35%

• pH 5.0（酸性微環(huán)境）：快速釋放，24 h 累計釋放 70%~90%

方案二：共價偶聯(lián)載藥（化學鍵合，長效緩釋、泄漏少）

適用場景

1. 反應原理

2. 投料摩爾比

3. 實驗步驟

1. 將藥物溶于 pH=5.5 MES 緩沖液，加入 EDC、NHS，室溫活化 30 min（活化羧基）；

2. 將上述活化液緩慢滴入 G5-NH? 水溶液，室溫避光攪拌 24 h；

3. 終止反應后，透析純化（MWCO 8000 Da，超純水透析 48 h），除去未反應小分子；

4. 過濾除菌，得到 G5 - 藥物 共價偶聯(lián)物。

4. 特點

• 幾乎無藥物突釋，體內(nèi)循環(huán)穩(wěn)定性遠優(yōu)于物理包埋；

• 僅在細胞內(nèi)酶解 / 酸性環(huán)境下斷裂酰胺鍵釋藥；

• 載藥量略低于物理包埋，一般 LC ≈ 5%~9%。

四、優(yōu)化要點 & 常見問題解決

1. 團聚問題

• 滴加藥物 / 反應液務必緩慢，全程低速攪拌；

• 體系鹽濃度不宜過高，高鹽會壓縮雙電層導致聚集。

2. 包封率偏低

• 延長攪拌時間至 24 h；適當提高藥物投料比（不超過 1:40）。

3. G5 細胞毒性（游離氨基導致）

• 表面接枝少量 mPEG（5%~10% 氨基改性），大幅降毒，不影響載藥能力。