一、實驗前準備

（一）主要試劑：

Pluronic F127、Rhod-2 AM、RH237、無水DMSO、RPMI 1640培養(yǎng)基、B27添加劑、FBS、Y-27632、TrypLE™ Select消化酶、1.8 mM含鈣臺氏液。

（二）主要溶液配方：

1. 培養(yǎng)基：RPMI 1640+B27

2. 消化酶：TrypLE™ Select 酶 (10X)

3. 含鈣臺氏液（1.8mM）

（一）三維心肌球制備

1. 取hiPSC誘導分化的心肌細胞，經(jīng)TrypLE™ Select酶溫和消化后，離心收集細胞并進行細胞計數(shù)，用RPMI 1640+B27 +10%FBS+10 μM Y-27632培養(yǎng)基重懸。

2. 將細胞懸液接種至超低吸附96 孔超低吸附U型底板，每孔加入100 μL 細胞懸液（約含10000～20000 個細胞），轉(zhuǎn)速為1000 rpm，離心3 min，使細胞聚集于孔底，次日更換培養(yǎng)基為RPMI 1640+B27。

3. 將培養(yǎng)板置于37 ℃、5% CO₂恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)，24～48 h內(nèi)細胞可自發(fā)聚集形成規(guī)則三維心肌球，培養(yǎng)48 h后顯微鏡下可觀察到自主節(jié)律性搏動。

4. 培養(yǎng)期間每2天半量更換新鮮RPMI 1640+B27培養(yǎng)基，清除代謝廢物、補充營養(yǎng)，成球后培養(yǎng)至第7天，選取800 μm左右、搏動穩(wěn)定的心肌球用于后續(xù)染色與檢測實驗。

（二）Rhod-2 AM與RH237共染

1. Rhod-2 AM母液及工作液配制：取Rhod-2 AM粉末，用無水DMSO充分溶解配制成5 mM 母液，避光分裝后-20 ℃凍存；實驗前取分裝母液，用含0.1% Pluronic F127的預熱含鈣臺氏液稀釋至終濃度2.5 μM，輕柔渦旋混勻備用。

2. 從培養(yǎng)箱取出心肌球，用37 ℃預熱含鈣臺氏液輕柔洗滌1～2 次，去除殘留培養(yǎng)基、代謝廢物及血清成分，避免干擾染料負載。

3. 棄去洗滌液，加入配制好的Rhod-2 AM工作液，wan quan浸沒心肌球，置于37 ℃培養(yǎng)箱避光孵育30 min。

4. 孵育結(jié)束后吸棄染液，用預熱含鈣臺氏液漂洗1 次，去除胞外游離染料及殘留AM酯。

5. RH237母液及工作液配制：RH237粉末用無水DMSO溶解，配制成1～10 mM母液，避光分裝-20 ℃保存；實驗前用預熱含鈣臺氏液稀釋至工作濃度0.5～5 μM，渦旋混勻。

6. 再次用預熱含鈣臺氏液輕柔洗滌心肌球1～2 次，棄廢液，加入wan quan覆蓋心肌球的RH237工作液。

7. 37 ℃條件下避光孵育15～30 min，完成細胞膜電壓探針標記。

8. 孵育完畢吸棄染液，用預熱臺氏液充分漂洗心肌球，洗去未特異性結(jié)合的游離染料，降低背景熒光干擾，保留膜上特異性熒光信號。