ADPG焦磷酸化酶（AGP）活性檢測試劑盒（微量法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1036

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

產(chǎn)品說明:

AGP (EC 2.7.7.21)主要存在于植物中，催化葡萄糖-1-磷酸與ATP反應(yīng)生成淀粉合成的直接前體ADPG，是植物淀粉生物合成的主要限速步驟。

AGP催化的逆向反應(yīng)生成G-1-P，在反應(yīng)體系中添加的磷酸己糖變位酶和6-磷酸葡萄糖脫氫酶依次催化生成6- 磷酸葡萄糖酸和NADPH，340nm下測定NADPH增加速率，即可計(jì)算AGP活性。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進(jìn)行檢測。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑二：臨用前每支加入6.4mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存；

2. 試劑三：臨用前加入2mL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存；

3. 試劑四：臨用前每支加入500μL雙蒸水充分溶解備用；用不完的試劑-20℃分裝保存；

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板（UV板）、研缽/勻漿器、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

稱取約0.1g組織加入1mL提取液，冰浴中勻漿。10000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

二、測定步驟

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 在EP管中按順序加入下列試劑

混勻后立即在340nm波長下記錄初始吸光度A1和2min后的吸光度A2，計(jì)算ΔA=A2-A1。

二、AGP活性計(jì)算

a.使用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下：

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP活性（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（Cpr×V樣本）=380.5×ΔA÷Cpr

（此法需要自行測定粗酶液蛋白質(zhì)濃度）

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP活性（U/g 質(zhì)量）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（W×V樣本÷V提?。?/span>=380.5×ΔA÷W

T：反應(yīng)時(shí)間，15min；ε：NADPH消光系數(shù)，6.22×10^-3mL/nmol/cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.284mL；d：石英比色皿光程，1cm；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.008mL；V提取：加入的提取液體積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g。

b.使用96孔UV板測定的計(jì)算公式如下：

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活性單位。

AGP活性（U/mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（Cpr×V樣本）=634.1×ΔA÷Cpr

（此法需要自行測定粗酶液蛋白質(zhì)濃度）

2. 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘催化產(chǎn)生1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

AGP活性（U/g 質(zhì)量）＝ΔA÷（ε×d）×V反總÷T÷（W×V樣本÷V提取）=634.1×ΔA÷W

T：反應(yīng)時(shí)間，15min；ε：NADPH消光系數(shù)，6.22×10 ^-3mL/nmol/cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.284mL；d：96 孔板光程，0.6cm；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；V樣本：加入的樣本體積，0.008mL；V提?。杭尤氲奶崛∫后w 積，1mL；W：樣本質(zhì)量，g。

注意事項(xiàng)：

如果一次性測定樣本較多，可以將試劑一、二按比例配成混合液1，將試劑一、三、四和五按比例配成混合液2。