經(jīng)常接觸液相的小伙伴肯定都知道等度洗脫和梯度洗脫這兩種說法。顧名思義，等度洗脫是流動(dòng)相中有機(jī)相和水相比例一直保持在一個(gè)值不變化；梯度洗脫則是比例隨著時(shí)間的變化而變化。

那么，這兩者的區(qū)別是什么呢？什么時(shí)候該用哪種洗脫方式？下面用作者的理解和大家分享。

化合物在色譜柱種“跑步”

在色譜柱中，化合物因?yàn)闃O性不同，因此在流動(dòng)相和固定相之間的保留能力不同，從而發(fā)生分離。換句話說，因?yàn)榛衔铩芭堋钡乃俣炔煌谕瑯娱L(zhǎng)度的色譜柱中，自然到達(dá)“終點(diǎn)”的時(shí)間也不同。

可以把色譜分離比作100米賽跑：

跑道 → 色譜柱

運(yùn)動(dòng)員 → 化合物

運(yùn)動(dòng)員跑步的速度主要取決于其實(shí)力和狀態(tài)，當(dāng)然場(chǎng)地、跑鞋、風(fēng)阻等也可能對(duì)成績(jī)?cè)斐捎绊?。在色譜分離中，色譜保留由極性、分配系數(shù)、吸附作用、氫鍵、離子作用等共同決定，但要論影響最大的，就是化合物的極性。這相當(dāng)于是運(yùn)動(dòng)員自身的實(shí)力和狀態(tài)，而流動(dòng)相成分和比例的改變，則是可以調(diào)控化合物“速度”的主要因素。

因此，這里我們可以將運(yùn)動(dòng)員的技巧和實(shí)力當(dāng)成是流動(dòng)相賦予化合物的速度。每個(gè)運(yùn)動(dòng)員的技巧和實(shí)力都不一樣，除了平均速度之外，還存在起跑速度和加速度等差異。假設(shè)從起步開始，大家的速度一直保持在各自的最好水平，這種情況下，第一名和最后一名肯定還是差距較大。例如，博爾特和作者相比，分離度會(huì)非常理想：博爾特跑100米只需9秒58，而作者9秒58只能跑50米。

然而，當(dāng)水平相當(dāng)時(shí)，第一名和第二名到達(dá)終點(diǎn)的時(shí)間差可能很小，甚至只有零點(diǎn)幾秒或零點(diǎn)零幾秒。這對(duì)應(yīng)到色譜中，就是極性相似的化合物如果速度一直不變，很難分開。要不把跑道變長(zhǎng)，要不命令他們將各自的速度等比例下降，但這樣會(huì)增加分析時(shí)間、浪費(fèi)資源、提高檢測(cè)成本，還可能導(dǎo)致峰形變差。

幸運(yùn)的是，如上所述，由于每個(gè)運(yùn)動(dòng)員的實(shí)力和技巧不同，他們可以跑得不一樣，這正是我們可以利用的特點(diǎn)。通常，實(shí)力更強(qiáng)的運(yùn)動(dòng)員（即初速度更大）、技巧更高（加速能力更強(qiáng)），在同樣條件下能夠達(dá)到更大的速度差異，如下圖所示。

這相當(dāng)于是對(duì)他們下了另外一個(gè)命令，按照不同的加速度來加速，跑最快的博爾特不但一開始就跑得快，加速也快，諾亞·萊爾斯的加速會(huì)慢一點(diǎn)，而像作者的話加不加速也無所謂了。

等度洗脫與梯度洗脫

現(xiàn)在回到一開始的問題，分離其實(shí)就是通過控制流動(dòng)相的比例，來調(diào)節(jié)化合物的速度。等度和梯度洗脫的本質(zhì)區(qū)別就是給化合物下達(dá)不同的命令：

等度洗脫：可通過調(diào)整比例、柱溫、pH改變化合物的保留。

梯度洗脫：通過連續(xù)或階梯改變洗脫強(qiáng)度。

所以，什么時(shí)候該用等度洗脫，什么時(shí)候該用梯度洗脫，答案就清楚了。

我們想要的理想結(jié)果是：化合物在達(dá)到色譜柱終點(diǎn)的時(shí)候能有很好的分離度。

就像賽跑中，運(yùn)動(dòng)員沖線之后，我們可能無法馬上知道誰(shuí)是，還得靠?jī)x器判定；而在色譜分析中，我們當(dāng)然希望用眼睛就能直接區(qū)分各組分。

案例分析

色譜柱：Ultimate XB-C18 4.6×100 mm 3μm

等度洗脫

流動(dòng)相：A = 乙腈，B = 0.1%甲酸水溶液

比例：A:B = 5:95

流速：0.5 mL/min

總結(jié)與建議

一般情況下，可以使用保留差異（k 值范圍）來判斷是否使用梯度洗脫，通常認(rèn)為 1 < k < 10 是最佳保留范圍。對(duì)于組分較多的情況，也可放寬到0.5~20，因此色譜中的目標(biāo)物可根據(jù)此參考值來選擇適合的洗脫方式進(jìn)行調(diào)整。

但這并不是絕對(duì)的，需要我們根據(jù)實(shí)際情況來進(jìn)行分析，歡迎大家進(jìn)行討論和經(jīng)驗(yàn)交流。