背景介紹

● DBCO：二苯并環(huán)辛炔（無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)核心基團(tuán)）

● carboxyrhodamine 110：羧基羅丹明 110（熒光染料，綠色熒光）

● DBCO-carboxyrhodamine 110：DBCO 修飾羧基羅丹明 110 熒光探針

● 疊氮細(xì)胞： Ac?ManNAz 代謝標(biāo)記疊氮細(xì)胞

● 工作原理：無(wú)銅點(diǎn)擊化學(xué)反應(yīng)（SPAAC），DBCO 與疊氮（-N?）自發(fā)共價(jià)結(jié)合，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞熒光標(biāo)記

一、反應(yīng)原理

• 染料：Carboxyrhodamine 110（CR110）綠色熒光

• 激發(fā)波長(zhǎng)：~495 nm

• 發(fā)射波長(zhǎng)：~520 nm

• 全程無(wú)需銅離子、無(wú)需催化劑，細(xì)胞毒性極低

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二、實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備

•待標(biāo)記細(xì)胞：Ac4ManNAz 預(yù)處理過(guò)的疊氮細(xì)胞（實(shí)驗(yàn)組）

•陰性對(duì)照：不加 Ac4ManNAz 的普通細(xì)胞

•試劑

• -DBCO-Carboxyrhodamine 110 粉末

• -DMSO（母液溶劑）

• -PBS 緩沖液

• -基礎(chǔ)培養(yǎng)基（無(wú)血清培養(yǎng)基最佳）

• 4-% 多聚甲醛（固定用，可選）

  •母液配制

• -配制 10 mM DBCO-CR110 母液：粉末溶于無(wú)水 DMSO

• -分裝避光 -20℃保存，避免反復(fù)凍融

• -工作終濃度：1 μM（細(xì)胞標(biāo)記通用初始測(cè)試濃度）

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ClickChemistrytools DBCO - 羧基羅丹明110 記疊氮修飾細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方法

三、完整操作步驟（活細(xì)胞標(biāo)記?流式細(xì)胞術(shù)專用）

1.收集細(xì)胞

貼壁細(xì)胞胰酶消化 / 懸浮細(xì)胞直接收集，1200 rpm，5 min 離心棄上清。

2.PBS 洗滌 1 次，重懸細(xì)胞。

3.稀釋探針

用無(wú)血清基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋 10 mM 母液至工作濃度 1 μM。

禁止用含疊氮鈉 NaN?的 PBS / 培養(yǎng)基，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性封閉反應(yīng)！

4.孵育標(biāo)記

細(xì)胞重懸于含 DBCO-CR110 的無(wú)血清培養(yǎng)基中，

室溫避光孵育 30 min。

5.充分洗滌

孵育結(jié)束，PBS 洗滌 2~3 次，每次 1200 rpm 5 min，洗去未結(jié)合游離染料。

6.檢測(cè)

重懸于 PBS，直接上機(jī)流式細(xì)胞儀綠色通道檢測(cè)。

四、免疫熒光爬片細(xì)胞標(biāo)記步驟（共聚焦顯微鏡用）

1.細(xì)胞爬片經(jīng) Ac4ManNAz 代謝培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基。

2.PBS 輕柔清洗爬片 1 次。

3.加入含 1 μM DBCO-CR110 的無(wú)血清培養(yǎng)基。

4.室溫避光孵育 30 min。

5.PBS 充分洗滌 3 次，洗去游離探針。

6.可選：4% 多聚甲醛室溫固定 15 min。

7.DAPI 染核，封片，共聚焦顯微鏡觀察。

五、必須設(shè)置的對(duì)照組（排除假陽(yáng)性）

•空白對(duì)照：未加 Ac4ManNAz、未加探針的原始細(xì)胞

•染料本底對(duì)照：未用 Ac4ManNAz，僅加 DBCO-CR110 孵育洗滌

（驗(yàn)證非特異性吸附）

•疊氮實(shí)驗(yàn)組：Ac4ManNAz 細(xì)胞 + DBCO-CR110（陽(yáng)性信號(hào)組）

六、關(guān)鍵注意事項(xiàng)（非常容易踩坑）

•絕對(duì)不能含疊氮鈉（NaN?）

培養(yǎng)基、PBS 里的抑菌疊氮鈉會(huì)大量競(jìng)爭(zhēng) DBCO，直接導(dǎo)致標(biāo)記失敗、無(wú)信號(hào)。

•全程避光

CR110 熒光極易光淬滅，孵育、洗滌、檢測(cè)全程鋁箔包裹避光。

•血清影響小，但無(wú)血清孵育背景更低

血清蛋白輕微非特異吸附，無(wú)血清條件信噪比好。

•孵育時(shí)間不要過(guò)長(zhǎng)

30 min 足夠反應(yīng)；超過(guò) 1h 只會(huì)增加非特異性吸附，不增強(qiáng)信號(hào)。

•DMSO 終濃度＜0.1%，避免細(xì)胞毒性。

•該標(biāo)記在細(xì)胞膜表面，不進(jìn)入胞內(nèi)，對(duì)應(yīng)唾液酸膜糖蛋白定位。