6-磷酸葡萄糖脫氫酶（G6PDH）活性檢測(cè)試劑盒

（紫外分光光度法）

注意：正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1009

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

G6PDH（EC 1.1.1.49）廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，催化6-磷酸葡萄糖氧化為6 -磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，同時(shí)將NADP ⁺還原為NADPH，供生物合成及維持細(xì)胞內(nèi)的還原狀態(tài)用。因此6-磷酸葡萄糖脫氫酶活性的高低可以從一定程度上反映出生物體的生物合成和抗氧化能力。

G6PDH催化NADP ⁺還原生成NADPH，在340nm下測(cè)定NADPH增加速率。

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體50 mL×1瓶，4℃保存（切忌放-20℃）；

試劑二：粉劑×1支，4℃保存；用時(shí)每支加650μL雙蒸水充分溶解備用；

試劑三：粉劑×1支，4℃保存；用時(shí)每支加650μL雙蒸水充分溶解備用。  

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計(jì)、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1mL石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一、樣本的處理

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，棄上清，按照每500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：稱取約0.1g組織，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

二、測(cè)定步驟 

1、紫外分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一置37℃水浴預(yù)熱30 min。

3、工作液配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三以15：0.2：0.2比例混合。

4、加樣表：

于340nm處測(cè)定5min內(nèi)吸光值變化，第0s吸光值記為A1，第300s吸光值記為A2。記△A測(cè)定=A2測(cè)定-A1測(cè)定，△A空白=A2空白-A1空白。

三、G6PDH 活力單位的計(jì)算：

1、血清（漿）G6PDH活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol的NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/mL）＝[（△A測(cè)定-△A空白）÷（ε×d）×10⁹×V反總]÷V樣本÷T

=643×（△A測(cè)定-△A空白）

2、組織中G6PDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/mg prot）＝[（△A測(cè)定-△A空白）÷（ε×d）×10⁹×V反總]÷(V樣本×Cpr)÷T

=643×（△A測(cè)定-△A空白）÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/g 鮮重）＝[（△A測(cè)定-△A空白）÷（ε×d）×10⁹×V反總]÷(W÷V提取×V樣本)÷T

=643×（△A測(cè)定-△A空白）÷W

3、細(xì)菌或細(xì)胞中G6PDH活力的計(jì)算:

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/mg prot）＝[（△A測(cè)定-△A空白）÷（ε×d）×10⁹×V反總]÷(V樣本×Cpr)÷T

=643×（△A測(cè)定-△A空白）÷Cpr

（2）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol NADPH定義為一個(gè)酶活力單位。

G6PDH（U/10⁴cell）=[（△A測(cè)定-△A空白）÷（ε×d）×10⁹×V反總]÷(V樣本÷V提取×500)÷T

=1286×（△A測(cè)定-△A空白）

ε：NADPH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：1mL石英比色皿光徑，1cm；V反總：反應(yīng)總體積，0.001L；V樣本：加入樣本體積，0.05mL；T：反應(yīng)時(shí)間，5min；V提?。杭尤胩崛∫后w積，1mL；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本鮮重，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬；10⁹：?jiǎn)挝粨Q算系數(shù)，1mol =10⁹nmol 。

注意事項(xiàng)： 

1、實(shí)驗(yàn)時(shí)，樣本在冰上放置，以免變性和失活。試劑一37℃水浴放置。

2、比色皿中反應(yīng)液的溫度必須保持37℃，取小燒杯一只裝入一定量的37℃蒸餾水，將此燒杯放入37℃水浴鍋中。在反應(yīng)過程中把比色皿連同反應(yīng)液放在此燒杯中。

3、兩個(gè)人同時(shí)做此實(shí)驗(yàn)，一個(gè)人比色，一個(gè)人計(jì)時(shí)，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

4、若樣本測(cè)定初始值（0s）大于0.5而△A測(cè)定小于0.1，可將樣本稀釋后再行測(cè)定。