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Western Blotting（WB）實(shí)驗(yàn)流程
Western Blotting（WB）實(shí)驗(yàn)流程
Western blotting（蛋白質(zhì)印跡）使用抗體從復(fù)雜樣品中識(shí)別單個(gè)蛋白質(zhì)，并進(jìn)行半定量分析。首先，通過(guò)SDS-PAGE（聚丙烯酰胺凝膠電泳）將蛋白質(zhì)根據(jù)大小分離。接下來(lái)，通過(guò)施加電流將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上。最后，根據(jù)特定的抗原-抗體結(jié)合，可以通過(guò)特異性一抗檢測(cè)和分析負(fù)載了抗原的印跡膜。
蛋白質(zhì)印跡主要用于目標(biāo)蛋白質(zhì)特異性表達(dá)的定性或半定量分析，蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)-DNA相互作用的后續(xù)分析，以及蛋白質(zhì)修飾的鑒定分析。
圖1. WB的簡(jiǎn)單過(guò)程
1. 蛋白質(zhì)樣品準(zhǔn)備
1.1 蛋白質(zhì)樣品來(lái)源
蛋白質(zhì)樣品可以是可溶性蛋白質(zhì)液體、細(xì)胞/組織裂解液或免疫沉淀的蛋白質(zhì)。不同樣品的蛋白質(zhì)加載量有所不同，一般來(lái)說(shuō)，純化蛋白質(zhì)的推薦加載量不超過(guò)100 ng，細(xì)胞/組織裂解液的加載量可為10-40 μg。
1.2 蛋白質(zhì)樣品準(zhǔn)備
通常情況下，從動(dòng)物或植物組織或細(xì)胞中提取復(fù)雜的蛋白質(zhì)成分，提取過(guò)程中應(yīng)遵循以下原則：
a. 根據(jù)不同蛋白質(zhì)的特性選擇合適的提取方法。
b. 使用適當(dāng)?shù)姆椒▃ui大限度地提取目標(biāo)蛋白質(zhì)。
c. 在低溫下進(jìn)行操作，并添加蛋白酶抑制劑以防止蛋白質(zhì)降解。
d. 選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)裂解液以保持蛋白質(zhì)的溶解性。
e. 將蛋白質(zhì)樣品儲(chǔ)存于-80℃，避免反復(fù)凍融，盡快進(jìn)行檢測(cè)。
細(xì)胞培養(yǎng)物的裂解液制備
a. 當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)皿放在冰上，并用冰冷的磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌細(xì)胞3次。
b. 準(zhǔn)備含有蛋白酶抑制劑的裂解液。常用的蛋白酶抑制劑如下表（表2）所示。應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇合適的蛋白酶抑制劑。zui常用的蛋白酶抑制劑是PMSF（工作濃度為1 mM），它具有高毒性，使用時(shí)應(yīng)自我保護(hù)。它在水中的半衰期非常短，因此應(yīng)在使用前添加。
c. 向一個(gè)10 cm 培養(yǎng)皿中加入含有蛋白酶抑制劑的1 mL蛋白質(zhì)裂解液，輕輕搖晃，并在冰上裂解15-30分鐘。
d. 使用冷的塑料細(xì)胞刮刀將貼壁細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下，然后輕輕將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到一個(gè)1.5 mL EP管中，將管放在冰上。此時(shí)應(yīng)避免產(chǎn)生氣泡。
注：收集的細(xì)胞也可以通過(guò)超聲波wan全裂解。將超聲波探頭放置在樣品裂解液的中yang，但不要觸碰管壁或管底進(jìn)行超聲。我們使用的超聲波儀器是Scientz JY92-IIN，功率設(shè)定為10%（650 W），超聲時(shí)間為2秒，停止時(shí)間為3秒?；旧希瑧?yīng)將1 mL的細(xì)胞內(nèi)液懸浮液超聲裂解10-25個(gè)循環(huán)。
e. 在4℃下以12000 rpm離心10-15分鐘。
f. 輕輕吸取上清液放入另一個(gè)新的離心管中，放在冰上備用。注意不要吸取上層浮在上方的脂質(zhì)等雜質(zhì)。
g. 在蛋白質(zhì)定量后，加入適量的6×樣品加載緩沖液，95℃下煮沸5分鐘，然后以12000 rpm離心30秒，最后在-20℃保存。
樣品準(zhǔn)備注意事項(xiàng)：
所有步驟必須在低溫下進(jìn)行！低溫！低溫！
a. 對(duì)于懸浮生長(zhǎng)的細(xì)胞，以2500 rpm離心3分鐘進(jìn)行收集，然后進(jìn)行細(xì)胞洗滌和裂解程序。
b. 對(duì)于接受藥物處理的細(xì)胞，尤其是與凋亡相關(guān)的研究樣品，還應(yīng)收集培養(yǎng)基上清液。
c. 不建議使用蛋白酶來(lái)消化和收集細(xì)胞，因?yàn)檫@可能會(huì)引入蛋白質(zhì)雜質(zhì)或?qū)δ承┨囟ǖ鞍踪|(zhì)（特別是膜表面蛋白質(zhì)）造成損傷，從而干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
d. 裂解液中可能會(huì)出現(xiàn)一種黏稠的透明凝膠，這是基因組DNA的成分。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)取上清液。然而，當(dāng)目標(biāo)蛋白質(zhì)緊密結(jié)合于基因組時(shí)，需要通過(guò)超聲波破碎或注射器吸取的方式破壞凝膠，然后取上清液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，以避免蛋白質(zhì)損失。
e. PMSF在水溶液中不穩(wěn)定，通常在30分鐘內(nèi)降解一半。活性喪失的速度隨pH值的增加而增加，25℃下的失活速率高于4℃。如果樣品處理時(shí)間超過(guò)1小時(shí)，則需要再次添加。
f. 注意細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞傳代次數(shù)的影響。不同代數(shù)的癌細(xì)胞存在異質(zhì)性，因此細(xì)胞形態(tài)、遷移和侵襲能力可能會(huì)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致某些基因表達(dá)的變化。
一方面，由于細(xì)胞本身的一定異質(zhì)性，在一段時(shí)間的培養(yǎng)后，細(xì)胞的整體特性逐漸以適者生存的方式發(fā)生變化。
另一方面，在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，由于培養(yǎng)條件的變化或外部刺激的存在，例如培養(yǎng)試劑的更換、消化和傳代、細(xì)胞污染以及一些化學(xué)和物理刺激，細(xì)胞中相關(guān)基因的表達(dá)可能會(huì)受到影響，最終影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
在使用腫瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，應(yīng)首先保存，并盡量使用同一代數(shù)的相關(guān)細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，以避免由于過(guò)度傳代而導(dǎo)致的細(xì)胞異質(zhì)性，并最終導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致。
組織的裂解液制備
a. 收集新鮮樣品，并用生理鹽水或PBS洗滌，然后切割成適當(dāng)大小的塊狀?？梢栽诒鲜褂?-2 mL均質(zhì)器進(jìn)行組織均質(zhì)，或者加入液氮進(jìn)行研磨。推薦使用液氮研磨，因?yàn)榻M織塊不容易損壞，并且在均質(zhì)過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生摩擦熱。
b. 準(zhǔn)備含有蛋白酶抑制劑的裂解液。
c. 將含有蛋白酶抑制劑的適量裂解液（50 mg/500 μL）加入研磨的組織樣品中，并將管放在冰上裂解15-30分鐘，同時(shí)間歇性混合以充分裂解。
注：為確保組織細(xì)胞充分裂解，建議使用超聲波。調(diào)整超聲系統(tǒng)至適當(dāng)?shù)念l率和功率（超聲功率不宜過(guò)大），設(shè)置超聲波間歇以防止超聲探頭過(guò)熱。將超聲波探頭放置在樣品裂解液的中yang，但不要觸碰管壁或管底，進(jìn)行冰浴超聲。
d. 在4℃下以12000 rpm離心10-15分鐘。
e. 小心取出EP管，將上清液吸取到一個(gè)新的管中。注意不要吸取上層浮在上方的脂質(zhì)等雜質(zhì)，然后放在冰上備用。
f. 在4℃下以12000 rpm離心10-15分鐘。
注：組織樣品必須清潔，去除血管，沖洗血液，以避免樣品中的IgG干擾。
圖2. 裂解液制備過(guò)程
1.3 蛋白裂解物的選擇
對(duì)于大多數(shù)樣品，RIPA裂解緩沖液可用于快速細(xì)胞裂解。
表1. RIPA裂解緩沖液的組成
| RIPA裂解緩沖液 | |
Tris-HCl | 50 mM |
NACI | 150mM |
EDTA | 1 mM |
SDS(W/V) | 0.1% (W/V) |
SDS(W/V) | 0.1% (W/V) |
膽酸鈉1% | 1% (W/V) |
Triton X-100% | 1% (W/V) |
根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，可以向RIPA裂解緩沖液中添加適當(dāng)?shù)牡鞍酌敢种苿?/p> | |
蛋白質(zhì)裂解液的主要成分及其作用如下：
● 緩沖液
具有一定pH范圍的緩沖液可以為蛋白質(zhì)提供穩(wěn)定的環(huán)境，并增加蛋白質(zhì)的溶解性。常用的是Tris-HCl或HEPES緩沖液，pH值在生理pH范圍內(nèi)。 Tris-HCl緩沖液（pKa = 8.1）的pH范圍為7.0-9.2，對(duì)溫度敏感。HEPES緩沖液（pKa = 7.55）的pH值范圍為6.5-8.5。
● 鹽
適當(dāng)?shù)柠}離子濃度可以維持蛋白質(zhì)的溶解性。選擇近似生理狀態(tài)下的150 mM NaCl不會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解和蛋白質(zhì)之間的相互作用。
● 螯合劑
螯合金屬離子用于防止蛋白質(zhì)提取物過(guò)于黏稠，降低溶解性。此外，螯合劑還可以與某些酶相互作用，抑制酶活性。
● 還原劑
添加一定量的還原劑可以保護(hù)蛋白質(zhì)上的游離巰基免受氧化，從而避免蛋白質(zhì)聚集或變性。β-巰基乙醇和二硫蘇糖醇（DTT）是常用的還原劑，后者比前者更*。通常，β-巰基乙醇具有揮發(fā)性，并且在加入緩沖液后會(huì)在短時(shí)間內(nèi)被氧化，從而可能影響蛋白質(zhì)的活性，其工作濃度為5-20 mM/L。DTT具有更強(qiáng)的還原能力，在氧化后可以形成穩(wěn)定的分子內(nèi)二硫鍵而不影響蛋白質(zhì)的巰基。其工作濃度為0.5-1 mM/L。基本上，長(zhǎng)期儲(chǔ)存建議使用DTT，但DTT溶液不穩(wěn)定，需在制備后立即使用。
● 表面活性劑
表面活性劑是一種界面活性劑，其疏水段插入到膜的磷脂雙層中，改變其滲透性，最終破壞膜結(jié)構(gòu)。因此，表面活性劑的強(qiáng)度直接決定了裂解細(xì)胞的能力。裂解液中使用的表面活性劑主要分為兩類(lèi)：陰離子表面活性劑和非離子表面活性劑。常用的表面活性劑如下：
SDS：陰離子表面活性劑，具有很強(qiáng)的破壞力，基本上可以溶解所有蛋白質(zhì)，并破壞其天然構(gòu)象結(jié)構(gòu)。SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合比例為1.4：1，可以有效覆蓋蛋白質(zhì)本身的電荷。SDS的臨界膠束溫度稍高，因此在低溫下可能出現(xiàn)沉淀，并且在存在鉀鹽的情況下沉淀會(huì)更明顯。此外，溶液的離子強(qiáng)度越強(qiáng)，離子性表面活性劑的臨界膠束濃度越低，使蛋白質(zhì)更易溶解。
NaDOC：一種離子性表面活性劑，比SDS弱一些。
Triton X-100：一種非離子表面活性劑。它可以破壞蛋白質(zhì)與脂質(zhì)之間的相互作用，但不會(huì)使蛋白質(zhì)變性，也不會(huì)破壞蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的連接。它可以保持蛋白質(zhì)的天然構(gòu)象。它的臨界膠束濃度較低，可以在64℃時(shí)觀察到兩相分離現(xiàn)象。
NP-40：一種非離子表面活性劑，對(duì)細(xì)胞核膜的破壞較弱，但對(duì)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的結(jié)合能力，可以保證蛋白質(zhì)的溶解度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，因此特別適用于在非變性條件下溶解膜蛋白質(zhì)。
Tween 20：一種溫和的非離子表面活性劑，對(duì)蛋白質(zhì)的溶解能力較差，不會(huì)破壞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，不是蛋白質(zhì)裂解液的常見(jiàn)成分。
選擇表面活性劑取決于要提取的蛋白質(zhì)的性質(zhì)和實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。選擇表面活性劑時(shí)需要考慮許多因素，包括充分裂解細(xì)胞和溶解蛋白質(zhì)，以及提取蛋白質(zhì)的狀態(tài)（變性或保持天然狀態(tài)）。
● 蛋白酶抑制劑
在蛋白質(zhì)提取過(guò)程中，細(xì)胞和組織的破壞會(huì)釋放大量的蛋白酶。為了抑制蛋白酶活性，樣品必須保持在低溫下，并加入適量的蛋白酶抑制劑以防止目標(biāo)蛋白質(zhì)的降解。
表2. 常用的蛋白酶抑制劑
| 蛋白酶抑制劑 | 功能 | 作用濃度 | 特性 |
|---|---|---|---|
PMSF | 絲氨酸蛋白酶抑制劑 半胱氨酸蛋白酶抑制劑 | 0.5-1 mM | MSF在水中的半衰期很短，需要在使用前不久添加。劇毒，實(shí)驗(yàn)操作時(shí)應(yīng)注意自我保護(hù) |
| APMSF | 絲氨酸蛋白酶抑制劑 | 0.4-4 mM | - |
| Pepstatin | 天冬氨酸蛋白酶抑制劑 | 1 μM | -4℃保存1周，-20℃保存1個(gè)月;避免重復(fù)凍融循環(huán)。 |
| Leupeptin | 絲氨酸蛋白酶抑制劑和半胱氨酸蛋白酶抑制劑 | 10-100 μM | -4℃保存1周，-20℃保存1個(gè)月;避免重復(fù)凍融循環(huán)。 |
| Aprotinin | 絲氨酸蛋白酶抑制劑 | 0.01-0.03 μM | -4℃保存1周，-20℃保存1個(gè)月;避免重復(fù)凍融循環(huán)。 |
| Na3VO4 | 磷酸酶抑制劑 | 1 mM | 需要被激活。溶解后加酸調(diào)節(jié)pH至10，加熱煮沸至無(wú)色，室溫冷卻，再調(diào)節(jié)pH至10。重復(fù)上述步驟，直到溶液保持無(wú)色，pH穩(wěn)定在10，等分并保存在-20°C。 |
| NaF | 磷酸酶抑制劑 | 10-20 mM | - |
2. 蛋白質(zhì)定量
為了定量樣品中感興趣的蛋白質(zhì)，需要確定樣品中總蛋白質(zhì)的含量。當(dāng)總蛋白質(zhì)的含量保持恒定時(shí)，目標(biāo)蛋白質(zhì)的表達(dá)水平的差異就會(huì)體現(xiàn)出來(lái)。
表3. 常用的化學(xué)定量方法
| 方法 | 原理 | 干擾因素 | 特性 |
布拉德福定量法 | 在酸性條件下，蛋白質(zhì)與G-250的結(jié)合使染料的zui大吸收波長(zhǎng)發(fā)生偏移。在一定范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)含量與595 nm吸收峰呈線性關(guān)系。 | 該試驗(yàn)受到強(qiáng)堿性緩沖液和高濃度洗滌劑的干擾 | 快速、高靈敏度，zui低檢出限為1μg。該蛋白-染料配合物消光系數(shù)高，顏色穩(wěn)定。該分析主要用于堿性或芳香氨基酸的檢測(cè)，因?yàn)樗鼘?duì)蛋白質(zhì)有很高的選擇性。 |
定量試劑盒 | 在堿性條件下，蛋白質(zhì)將Cu2+還原為Cu+， Cu+與BCA反應(yīng)形成紫色絡(luò)合物。該配合物在562 nm處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系。 | 該方法適用于高脂含量樣品的檢測(cè)，并能耐受一定濃度的洗滌劑。 | 快速靈敏，抗干擾能力強(qiáng)，檢出限可達(dá)0.5 μg。與Bradford試驗(yàn)相比，蛋白質(zhì)之間的差異較小 |
勞里測(cè)定法 | 在堿性條件下，Cu2+與蛋白質(zhì)中的肽鍵反應(yīng)形成絡(luò)合物，使Folin-Ciocalteu試劑還原，生成藍(lán)色絡(luò)合物。顏色的深淺和蛋白質(zhì)濃度之間存在線性關(guān)系。 | - | 標(biāo)準(zhǔn)曲線不是一條直線，不同蛋白質(zhì)的顏色深淺不同，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)。 |
紫外-可見(jiàn)分光光度法(UV - Vis或UV/Vis) | 根據(jù)蛋白質(zhì)的物理性質(zhì)和朗伯-比爾定律，在給定波長(zhǎng)處的吸光度與蛋白質(zhì)濃度成線性關(guān)系。 | 該試驗(yàn)受不同蛋白質(zhì)中色氨酸和酪氨酸水平的干擾。 |
2.1 用Bradford方法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線
a. 準(zhǔn)備牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品：
將0.05克BSA溶解在5毫升PBS中，得到10毫克/毫升的BSA標(biāo)準(zhǔn)品。
b. 準(zhǔn)備庫(kù)馬司亮藍(lán)G-250染色液：
將50毫克庫(kù)馬司亮藍(lán)G-250溶解在25毫升90%乙醇中，加入50毫升磷酸（85%），用純水稀釋至500毫升。避光保存。
c. 稀釋蛋白樣品：
對(duì)蛋白樣品進(jìn)行1:10、1:20和1:40的稀釋。
d. 將BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至以下濃度。
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | |
濃度（mg/mL） | 0 | 0.05 | 0.075 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.3 | 0.4 |
e. 將稀釋后的BSA標(biāo)準(zhǔn)溶液和蛋白樣品各加入微孔板條的孔中，每孔加入20 μL，然后加入180 μL G250染色溶液，并充分混合。
f. 使用分光光度計(jì)在595 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線以計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
2.2 BCA法（請(qǐng)參考相應(yīng)試劑盒的說(shuō)明）
a. 準(zhǔn)備牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品：
a. 將BCA試劑A與試劑B按50:1（體積比）的比例混合制備BCA工作試劑，并在室溫下孵育24小時(shí)。
b. 將標(biāo)準(zhǔn)品溶解至與樣品使用的相同溶劑相同濃度的0.5 mg/L。
c. 逐漸加入梯度體積的標(biāo)準(zhǔn)溶液（0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，8 μL，12 μL，16 μL，20 μL）到微孔板孔中，并向每個(gè)孔中加入標(biāo)準(zhǔn)稀釋液，使最終體積為20 μL。
d. 向每個(gè)孔中加入200 μL BCA工作試劑，并在37℃下孵育30分鐘。
e. 使用分光光度計(jì)在562 nm波長(zhǎng)下測(cè)量吸光度。
f. 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白質(zhì)濃度。
3. 蛋白樣品制備
蛋白質(zhì)的變性涉及破壞蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)并暴露抗原表位，有助于抗體與目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合和后續(xù)檢測(cè)。為了變性蛋白質(zhì)，將蛋白樣品與2倍的樣品加載緩沖液按體積比1:1或6倍的樣品加載緩沖液按體積比5:1混合，將混合溶液在95℃下煮沸5分鐘。
膜蛋白在高溫下往往會(huì)聚集和沉淀，應(yīng)在37℃下處理30分鐘。
表4. 加載緩沖器組件
| 6×樣品上樣緩沖液 | |
|---|---|
| Tris-HCl (pH 6.8) | 6% (V×/V) |
| SDS | 4% (W/V) |
| Bromophenol blue | 0.2% (W/V) |
| Glycerol | 20% (V/V) |
| DTT | 9% (V/V) |
注：蛋白質(zhì)樣品的上樣量為每孔10-40 μg。過(guò)量的蛋白質(zhì)會(huì)導(dǎo)致皮膚發(fā)黑。 | |
4. SDS-PAGE
4.1 SDS-PAGE凝膠
聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺的聚合形成的，這導(dǎo)致形成具有分子篩性質(zhì)的凝膠結(jié)構(gòu)網(wǎng)絡(luò)。蛋白質(zhì)被大量帶有負(fù)電荷的SDS膠束包裹，覆蓋了蛋白質(zhì)本身的電荷，并為蛋白質(zhì)提供了均勻的電荷質(zhì)量比。SDS-PAGE的分辨率與丙烯酰胺和亞甲基雙丙烯酰胺交聯(lián)劑的濃度相關(guān)。不同濃度交聯(lián)劑形成的分子篩具有不同的孔徑，根據(jù)分子量可以提供各種不同的分離條件（詳見(jiàn)下文）。
表5. 凝膠百分比和相應(yīng)的蛋白質(zhì)大小
| 接枝率 | 蛋白質(zhì)大小(kDa) |
8% | 70-200 |
10% | 25-70 |
12% | 20-55 |
15% | 15-45 |
表6. 丙烯酰胺凝膠的組成與功能
| 成分 | 功能 |
丙烯酰胺 | 丙烯酰胺單體可以聚合形成聚丙烯酰胺凝膠。 |
N,N-Methylenebisacrylamide | 誘導(dǎo)長(zhǎng)聚合物鏈之間的交聯(lián)形成三維網(wǎng)絡(luò)。 |
Tris-HCl Buffer | 保持pH穩(wěn)定。 |
APS | 促進(jìn)交聯(lián)并提供自由基，促進(jìn)丙烯酰胺和N,N-亞甲基雙丙烯酰胺的聚合。 |
TEMED | 催化自由基的形成，加速聚合。 |
4.2 電泳緩沖液制備
常規(guī)的SDS-PAGE是一種用于分離分子量在30 kDa到250 kDa之間的蛋白質(zhì)的*工具。根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量選擇適當(dāng)?shù)姆蛛x凝膠濃度（見(jiàn)表5）。
表7. 電泳緩沖液(1L)組分
| 試劑 | 質(zhì)量 (g) |
甘氨酸 | 14.4 |
三羥甲基氨基甲烷 | 3 |
三羥甲基氨基甲烷 | 1 |
加入ddH2O，充分混合，pH值8.3。 | |
在甘氨酸-三氨基甲烷凝膠電泳系統(tǒng)中，使用恒定功率，將濃縮凝膠以60-80 V運(yùn)行，分離凝膠以100-120 V運(yùn)行。電壓越低，運(yùn)行速度越慢，可以獲得更好的分離效果。
然而，常規(guī)的甘氨酸-三氨基甲烷凝膠系統(tǒng)對(duì)于分離分子量較?。?lt;30 kDa）的小分子蛋白質(zhì)的分辨率不高。三甘氨酸的電子遷移率和解離常數(shù)優(yōu)于甘氨酸，這在濃縮凝膠中為小分子蛋白質(zhì)提供了更好的濃縮效應(yīng)，在分離凝膠中獲得更高的分辨率。
表8. 推薦的電泳緩沖液用于小分子蛋白質(zhì)
| 試劑 | 質(zhì)量(g) | 注釋 | |
陽(yáng)極緩沖(1L緩沖系統(tǒng)) | Tris | 24.228 | 將Tris溶于ddH2O中，充分混合，調(diào)整pH至8.9。 |
陰極緩沖器(1L緩沖系統(tǒng)) | Tricine | 17.92 | 將試劑溶解在ddH2O中，充分混合。 |
Tris | 12.114 | ||
SDS | 1 |
我們建議在三甘氨酸-三氨基甲烷凝膠中以恒定電壓（60-100 V）進(jìn)行電泳。
4.3 蛋白質(zhì)標(biāo)記物和負(fù)載對(duì)照
根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，使用適當(dāng)?shù)膶?duì)照非常重要。
分子量指示劑：覆蓋適當(dāng)范圍分子量的蛋白質(zhì)標(biāo)記物可以指示蛋白質(zhì)的分子量，并在一定程度上反映電泳效果和膜轉(zhuǎn)移效率。根據(jù)不同特點(diǎn)，常用的標(biāo)記物大致可分為三類(lèi)：未染色標(biāo)記物、預(yù)染色標(biāo)記物和顯影標(biāo)記物。
表9. 不同蛋白標(biāo)記物的比較
| 蛋白標(biāo)記物 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
未染色標(biāo)記 | 無(wú)染色標(biāo)記物是最準(zhǔn)確的蛋白質(zhì)標(biāo)記物，它不攜帶染色分子或標(biāo)記分子，能準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)大小。 | 電泳過(guò)程中看不到未染色的標(biāo)記物，電泳和轉(zhuǎn)移過(guò)程無(wú)法實(shí)時(shí)監(jiān)控。它必須被弄臟才能被看見(jiàn)。 |
預(yù)染色標(biāo)記物 | 預(yù)染色標(biāo)記物是蛋白質(zhì)與染料共價(jià)偶聯(lián)的混合物，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可以用肉眼直接觀察到，并在電泳和轉(zhuǎn)移過(guò)程中作為參考。 | 由于染料偶聯(lián)，改變了電泳染色后蛋白質(zhì)分子的遷移效率，導(dǎo)致指示分子量的偏移，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)上漿不準(zhǔn)確。 |
暴露標(biāo)記 | 靶帶和標(biāo)記帶可以同時(shí)暴露，以減少錯(cuò)誤和蛋白質(zhì)的流動(dòng)性。 | 高成本 |
這解釋了為什么在免疫印跡中觀察到的帶狀大小與預(yù)測(cè)的大小不同。為了盡量減少預(yù)染色標(biāo)記物引起的分子量偏移的影響，可以將其與未染色標(biāo)記物進(jìn)行對(duì)比，以確定目標(biāo)帶的準(zhǔn)確分子量大?。ㄏ聢D左側(cè)顯示了預(yù)染色標(biāo)記物和未染色標(biāo)記物之間的差異）。此外，不同廠家的蛋白質(zhì)標(biāo)記物差異很大，客戶在選擇蛋白質(zhì)標(biāo)記物時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎（下圖右側(cè)顯示了不同廠家的預(yù)染色標(biāo)記物之間的差異）。在確定免疫印跡結(jié)果中的蛋白質(zhì)時(shí)，應(yīng)考慮到預(yù)染色標(biāo)記物引起的分子量偏移。
染色maker和未染色marker
來(lái)自不同制造商的染色標(biāo)記
陽(yáng)性對(duì)照：可以使用表達(dá)感興趣蛋白質(zhì)的細(xì)胞系組織或細(xì)胞裂解液作為陽(yáng)性對(duì)照。
負(fù)載對(duì)照：在各種組織和細(xì)胞中，由 housekeeping 基因編碼的蛋白質(zhì)水平相對(duì)恒定，這種蛋白質(zhì)可以在定量感興趣蛋白質(zhì)時(shí)作為負(fù)載對(duì)照，以確保每條凝膠槽中加載相同數(shù)量的蛋白質(zhì)。此外，負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)還可用于評(píng)估實(shí)驗(yàn)是否運(yùn)行成功。
圖3. 細(xì)胞的結(jié)構(gòu)
常見(jiàn)的內(nèi)部參考基因（housekeeping gene）：根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的，在研究不同蛋白質(zhì)時(shí)選擇正確的負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)非常重要。
選擇負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)時(shí)應(yīng)考慮以下因素：
表10. 基因在細(xì)胞的不同位置
| Nuclear | Nuclear membrane | Cytoplasm | Cellular membrane | Mitochondrion | Membrane | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 動(dòng)物組織/細(xì)胞 | 組蛋白H3 (17 kDa)， PCNA (29 kDa)) | Lamin B (66 kDa) | β-actin (43 kDa), GAPDH (36 kDa), Tubulin (5 kDa) | Na+/K+-ATP ase (120 kDa) | CoX IV(17 kDa), VDAC1 (30 kDa) | ATP1A1 (113 kDa) |
a.某些常規(guī)基因的表達(dá)水平可能會(huì)受到某些實(shí)驗(yàn)條件的影響，如外界刺激或藥物處理。在選擇負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)時(shí)，重要的是參考相關(guān)文獻(xiàn)并驗(yàn)證其在樣本中的表達(dá)是否恒定，且不受某些實(shí)驗(yàn)條件的影響。
b. 感興趣蛋白質(zhì)的分子量應(yīng)與負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)的分子量有所區(qū)別，以便進(jìn)行清晰的檢測(cè)和區(qū)分。如果負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)與感興趣蛋白質(zhì)具有相似的分子量，在可視化感興趣蛋白質(zhì)的帶狀條之后，使用主/次抗體去除液洗去抗體，然后再進(jìn)行負(fù)載對(duì)照抗體的孵育和負(fù)載對(duì)照蛋白質(zhì)的可視化。
4.4 凝膠電泳
a. 快速離心樣品以去除雜質(zhì)，建議將10-30 μg總蛋白質(zhì)加載到凝膠槽中。純化蛋白質(zhì)的推薦負(fù)載量為10-100 ng。根據(jù)結(jié)果需要調(diào)整負(fù)載量。
b. 在一個(gè)槽中加入分子量標(biāo)記物以指示感興趣蛋白質(zhì)。
c. 使用恒定電壓進(jìn)行電泳（電壓設(shè)定為120 V或更低）。為了獲得更好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在全蛋白質(zhì)在濃縮凝膠中遷移時(shí)，建議使用80 V。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)遷移到分離凝膠時(shí)，應(yīng)提高電壓。
d. 通常的電泳時(shí)間約為1.2小時(shí)。然而，分子量小于20 kDa的蛋白質(zhì)應(yīng)根據(jù)感興趣的蛋白質(zhì)縮短電泳時(shí)間。而大于100 kDa的蛋白質(zhì)，應(yīng)延長(zhǎng)電泳時(shí)間以獲得更好的蛋白質(zhì)分離效果。
5. 轉(zhuǎn)印
5.1 轉(zhuǎn)印方法
將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到固相介質(zhì)，通常使用濕式轉(zhuǎn)印和半干式轉(zhuǎn)印方法。這兩種轉(zhuǎn)印方法在原理上是相同的，只是施加電場(chǎng)的機(jī)械裝置和固定凝膠和膜的方法不同，半干式轉(zhuǎn)印使用浸潤(rùn)有緩沖溶液的多層濾紙。
表11. 轉(zhuǎn)移方式類(lèi)型的比較
| 方法 | 方法 | 缺點(diǎn) |
槽式轉(zhuǎn)印 | 膜轉(zhuǎn)印效果好，轉(zhuǎn)印時(shí)溫度可控。 | 需要較長(zhǎng)的時(shí)間，并且需要大量的傳輸緩沖區(qū)。 |
半干式轉(zhuǎn)印 | 膜傳輸效率高，時(shí)間短，傳輸緩沖液消耗少。 | 在膜轉(zhuǎn)移過(guò)程中，溫度無(wú)法控制，最終導(dǎo)致高本底溫度。 |
在轉(zhuǎn)印膜時(shí)，高電流下裝置在短時(shí)間內(nèi)會(huì)迅速產(chǎn)生熱量。因此，在轉(zhuǎn)印膜時(shí)需要采取措施保持低溫條件。在槽式轉(zhuǎn)印中，可以用冰水浸泡裝置進(jìn)行散熱，而在半干式轉(zhuǎn)印中，不適宜進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的電流通，因此我們建議在高分子量蛋白質(zhì)（100 kDa以上）的情況下使用槽式轉(zhuǎn)印。
對(duì)于低分子量和中分子量蛋白質(zhì)，半干式轉(zhuǎn)印和槽式轉(zhuǎn)印的效果幾乎相同。
注意：我們建議對(duì)高豐度的小凝膠使用半干式轉(zhuǎn)印。我們建議對(duì)低豐度的大凝膠使用槽式轉(zhuǎn)印。
5.2 膜的選擇
硝酸纖維素（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）是zui常用的轉(zhuǎn)印膜。
表12. NC膜與PVDF膜的比較
| NC膜 | PVDF膜 | |
|---|---|---|
蛋白結(jié)合量 | 80-100 μg/cm2 | 100-300 μg/cm2 |
結(jié)合強(qiáng)度 | 低 | 高 |
物理特性 | 易碎 | 耐用且有彈性 |
是否需要激活 | 無(wú)需激活 | 酒精激活 |
膜的結(jié)合能力主要與其純度有關(guān)，純度越高，蛋白質(zhì)的結(jié)合能力就越強(qiáng)。然而，高純度的硝酸纖維素膜易碎且容易破裂。與硝酸纖維素膜相比，聚偏氟乙烯（PVDF）膜不僅具有更強(qiáng)的蛋白質(zhì)結(jié)合能力，還具有更好的化學(xué)抗性。
請(qǐng)注意，在使用聚偏氟乙烯膜之前，應(yīng)用甲醇浸泡（>15秒）激活膜上的正電荷基團(tuán)，并在膜緩沖液中平衡一段時(shí)間。此外，PVDF膜和硝酸纖維素膜具有不同的孔徑。
對(duì)于小分子蛋白質(zhì)（<20 kDa），我們建議采用0.22 μm的孔徑膜，以避免超過(guò)轉(zhuǎn)移的限制。
對(duì)于大多數(shù)情況，建議使用0.45 μm的孔徑膜。
5.3 蛋白質(zhì)分離和膜轉(zhuǎn)印條件優(yōu)化
● 關(guān)于小分子蛋白質(zhì)的膜轉(zhuǎn)印，我們可以基于以下幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：
a. 增加交聯(lián)劑的濃度，并使用15%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。然而，針對(duì)15 kDa以下的蛋白質(zhì)，15%丙烯酰胺凝膠的分辨率較低，因此我們建議在堆積凝膠和分離凝膠之間添加10%的中間層凝膠，以增加小分子蛋白質(zhì)的分辨率。
b. 將Tris-Glycine緩沖系統(tǒng)替換為T(mén)ris-Tricine電泳系統(tǒng)，以獲得更好的濃縮和分離效果。請(qǐng)注意，在使用Tris-Tricine時(shí)，電壓應(yīng)適中，60 V-80 V為宜。
c. 選擇0.22 μm的孔徑膜。
d. 縮短膜轉(zhuǎn)印時(shí)間。
● 關(guān)于大分子蛋白質(zhì)的膜轉(zhuǎn)印，我們可以基于以下幾個(gè)方面進(jìn)行優(yōu)化：
a. 降低交聯(lián)劑的濃度，使用8%-5%丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。請(qǐng)注意，凝膠濃度越低，膜越脆弱，請(qǐng)?jiān)诓僮鲿r(shí)小心處理。
b. 在轉(zhuǎn)印過(guò)程中，適當(dāng)提高電流，延長(zhǎng)膜轉(zhuǎn)印時(shí)間，避免產(chǎn)生熱量。建議在4℃溫度下進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間（過(guò)夜）的槽式轉(zhuǎn)印。
c. 減少轉(zhuǎn)印緩沖液中的甲醇含量有助于將SDS分子與蛋白質(zhì)分離。高濃度甲醇固定蛋白質(zhì)對(duì)大分子蛋白質(zhì)不利，建議將甲醇濃度降低到10%。
5.4 轉(zhuǎn)印效率監(jiān)測(cè)
a. 預(yù)染標(biāo)記物的轉(zhuǎn)印結(jié)果反映了蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)印效率。
b. 使用朋酮染色劑染色，從染色的帶狀條判斷轉(zhuǎn)印是否成功。這個(gè)過(guò)程是可逆的，但不適用于尼龍膜。
朋酮染色溶液制備：將5%（體積/體積）乙酸，0.1%（質(zhì)量/體積）朋酮溶解在純水中，存放在4℃。
朋酮染色過(guò)程：
- 將轉(zhuǎn)印后的PVDF或NC膜浸泡在朋酮染色溶液中，搖擺5-10分鐘。
- 取出膜，用PBS洗滌3次×5分鐘。
- 觀察染色的紅色條帶并記錄轉(zhuǎn)印結(jié)果。
- 再次用PBS洗滌3次×5分鐘以去除結(jié)合的朋酮，以便進(jìn)行進(jìn)一步的Western blot分析。
c. 使用柯曼藍(lán)染色溶液染色，這個(gè)過(guò)程是不可逆的，但柯曼藍(lán)染色溶液的靈敏度高于朋酮染色溶液。
柯曼藍(lán)染色溶液制備：加入10%（體積/體積）冰醋酸、45%（體積/體積）甲醇、0.25%（質(zhì)量/體積）柯曼藍(lán)，純水混合均勻。
柯曼藍(lán)染色去染溶液制備：加入25%（體積/體積）甲醇、8%（體積/體積）冰醋酸，純水混合均勻。
柯曼藍(lán)染色過(guò)程：
- 將轉(zhuǎn)印后的PVDF和NC膜浸泡在柯曼藍(lán)染色溶液中，用搖床在室溫下緩慢搖動(dòng)1小時(shí)（根據(jù)凝膠的尺寸、厚度和溫度進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整），直到凝膠變藍(lán)。
- 倒掉染色溶液，將凝膠浸泡在去染溶液中，在室溫下用搖床緩慢搖動(dòng)4小時(shí)，直到藍(lán)色背景去染，蛋白質(zhì)條帶可見(jiàn)。
5.5 轉(zhuǎn)印緩沖液的制備
制備1L轉(zhuǎn)印緩沖液如下：
表13. 1L傳輸緩沖器的組件
| 試劑 | 質(zhì)量(g) |
|---|---|
| Glycine | 11.26 |
| Tris | 2.43 |
| Methanol | 200 mL |
| *加入ddH2O，充分溶解 | |
轉(zhuǎn)印緩沖液需要避光儲(chǔ)存，可以重復(fù)使用。
然而，由于甲醇具有揮發(fā)性，需要及時(shí)更換新鮮的轉(zhuǎn)印緩沖液。
5.6 轉(zhuǎn)印
a. 小心分離分離凝膠。
b. 使用濾紙-凝膠-濾紙制作“三明治”，保持“三明治”濕潤(rùn)并避免氣泡。制備“三明治”的步驟如下：
c. 根據(jù)制造商的說(shuō)明書(shū)組裝轉(zhuǎn)印裝置。將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素或PVDF膜上。對(duì)于分子量低于20 kDa的蛋白質(zhì)，推薦使用0.22 μm的膜。
d. 根據(jù)實(shí)際情況，通常有兩種選擇的轉(zhuǎn)印裝置，濕式轉(zhuǎn)印和半干式轉(zhuǎn)印。濕式轉(zhuǎn)印和半干式轉(zhuǎn)印對(duì)于常規(guī)大小的蛋白質(zhì)（20-100 kDa）都可以很好地工作，但由于半干式轉(zhuǎn)印可能產(chǎn)生更高的背景染色，濕式轉(zhuǎn)印更適用于高分子量蛋白質(zhì)。
e. 用PBS緩沖液沖洗印跡約5分鐘。
6. 阻斷
使用阻斷緩沖液在室溫下阻斷膜1小時(shí)。
選擇阻斷緩沖液
結(jié)合表面不平整，有許多小孔。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)被轉(zhuǎn)移到結(jié)合表面時(shí)，通過(guò)相互作用吸附到結(jié)合表面。然而，并不是所有的位點(diǎn)都被蛋白質(zhì)吸附，因此需要阻斷緩沖液吸附到剩余的結(jié)合位點(diǎn)，以防止抗體分子直接吸附到膜上導(dǎo)致偽陽(yáng)性或高背景結(jié)果。
選擇阻斷緩沖液的原則應(yīng)該是：
a. 阻斷緩沖液能夠阻斷結(jié)合膜上所有未結(jié)合的位點(diǎn)。
b. 阻斷緩沖液不干擾目標(biāo)蛋白質(zhì)的結(jié)合。它不與目標(biāo)蛋白質(zhì)的表位結(jié)合，也不與其他試劑發(fā)生交叉反應(yīng)。
以下是常用阻斷緩沖液的具體細(xì)節(jié)：
表14. 各種阻塞緩沖區(qū)的比較
阻斷緩沖液 | 優(yōu)點(diǎn) | 缺點(diǎn) |
5%脫脂奶粉 | 該成分復(fù)雜，含有許多不同分子量的蛋白質(zhì)，具有充分的阻斷作用。 | 不適合生物素-親和素和堿性磷酸酶檢測(cè)系統(tǒng)(由于脫脂奶粉中存在少量生物素和堿性磷酸酶殘留) |
1% 酪蛋白 | 它在中性和堿性條件下帶負(fù)電荷，并與帶正電荷的膜相互作用。 | 溶解度相對(duì)較差，不利于堵塞。 |
5% BSA | 該組件很簡(jiǎn)單，它與大多數(shù)情況兼容。 | 當(dāng)免疫原與BSA偶聯(lián)時(shí)，由于其具有一定的免疫原性，可能與抗體中殘留的BSA發(fā)生交叉反應(yīng)，產(chǎn)生一定的背景。 |
血清 | 不僅可以阻斷非特異性結(jié)合，血清中的抗體還可以阻斷樣品中可能存在的FC受體，以避免一抗和二抗對(duì)FC受體發(fā)生反應(yīng)。 | 成本相對(duì)較高。 |
非蛋白質(zhì)化合物 | 明膠、吐溫-20等可減少蛋白質(zhì)間的疏水相互作用，洗脫非特異性吸附，提高抗體的特異性識(shí)別能力。 |
不同阻塞緩沖區(qū)的對(duì)比實(shí)驗(yàn)如下:
圖4. 不同阻塞緩沖區(qū)的比較
注意：值得注意的是，對(duì)于磷酸化蛋白質(zhì)，不推薦使用脫脂奶粉和酪蛋白作為阻斷緩沖液，也不建議用TBST替代PBST。選擇阻斷緩沖液應(yīng)根據(jù)不同的結(jié)果進(jìn)行一些調(diào)整。對(duì)于大多數(shù)抗體，采用脫脂奶粉作為阻斷緩沖液可以達(dá)到良好的阻斷效果，但對(duì)于一些抗體，采用BSA作為阻斷緩沖液可以降低背景。此外，通常阻斷條件為室溫下1小時(shí)。
7. 一抗孵育
按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)稀釋一抗，通常一抗稀釋緩沖液的成分與阻斷緩沖液相同。此外，我們建議選擇經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的一抗，并將一抗在4℃下孵育過(guò)夜，以確?？乖涂贵w充分結(jié)合。
我們建議進(jìn)行梯度初步實(shí)驗(yàn)來(lái)確定一抗的適合稀釋比例，例如點(diǎn)印法。
a. 依次將不同加載量的樣品加載到NC膜上，自然風(fēng)干。
b. 樣品wan全吸附后，阻斷膜。
c. 根據(jù)加載梯度切割膜。
d. 分別使用不同濃度梯度的一抗和二抗孵育。
e. 最后，采用ECL發(fā)光底物孵育和顯影，根據(jù)顯影結(jié)果初步確定稀釋比例范圍。
圖5. Dot Blot
8. 二抗孵育
8.1 實(shí)驗(yàn)操作
a. 在二抗孵育前，用PBST/TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的一抗。
b. 適當(dāng)稀釋二抗，在室溫下孵育1小時(shí)。
c. 二抗孵育結(jié)束后，用PBST/TBST洗滌膜3次，每次10分鐘，以去除未結(jié)合的二抗。
8.2 二抗選擇
● 物種來(lái)源
我們不建議選擇兔、大鼠或小鼠物種的二抗，因?yàn)樗鼈兣c人類(lèi)物種的同源性較高，容易發(fā)生交叉反應(yīng)，從而導(dǎo)致高背景。常用的二抗物種來(lái)源是山羊或驢，但請(qǐng)注意，所選二抗的物種來(lái)源必須與所選一抗的物種來(lái)源不同，二抗的物種來(lái)源選擇取決于一抗的物種。
此外，如果使用的是單克隆一抗，則還需要注意亞型，并選擇針對(duì)一抗亞型的二抗。
● 純化方法
主要的純化方法有蛋白G/A純化和抗原親和純化。
蛋白G/A純化方法結(jié)合了血清中所有抗體IgG分子，沒(méi)有抗原特異性區(qū)分。
親和純化是一種通過(guò)與抗體特異識(shí)別的配體或受體結(jié)合來(lái)洗脫的方法。通過(guò)這種方法可以純化血清中的特定抗體成分。因此，具有抗原親和純化方法的二抗會(huì)降低非特異性結(jié)合并提高檢測(cè)蛋白的特異性。
● 適合的共軛
在Western Blot驗(yàn)證中，zui常用的二抗共軛是辣根過(guò)氧化物酶（HRP）共軛，如辣根過(guò)氧化物酶（HRP）和堿性磷酸酶（AP）。
常用作底物的HRP具有高特異性、穩(wěn)定、快速和經(jīng)濟(jì)的特點(diǎn)。雖然AP更為敏感，但背景通常較高，并且可能存在于實(shí)驗(yàn)樣品中的內(nèi)源性磷酸酶可能對(duì)結(jié)果產(chǎn)生干擾。
此外，如果使用AP共軛的二抗，請(qǐng)注意選擇合適的阻斷緩沖液，以避免磷酸酶的干擾。
圖6. 稀釋范圍根據(jù)不同制造商的說(shuō)明
9. 圖像顯現(xiàn)
● 化學(xué)發(fā)光顯現(xiàn)
Luminol是zui經(jīng)典的辣根過(guò)氧化物酶（HRP）化學(xué)發(fā)光底物之一，在H2O2存在下與辣根過(guò)氧化物酶發(fā)生酶催化反應(yīng)，具有高靈敏度和良好的成像特性，可以在膠片上顯現(xiàn)。
● 底物顯現(xiàn)
有許多種HRP染色底物，zui常用的是DAB。它通過(guò)與HRP反應(yīng)形成不溶性棕色沉淀物來(lái)顯現(xiàn)，同時(shí)具有高靈敏度。
然而，它需要在點(diǎn)滴上使用，并且具有致癌性，請(qǐng)?jiān)诓僮鲿r(shí)注意安全。
● 熒光顯現(xiàn)
通過(guò)使用適當(dāng)?shù)臒晒舛?，可以?shí)現(xiàn)熒光二抗顯現(xiàn)，彌補(bǔ)了化學(xué)發(fā)光和底物顯現(xiàn)在定量上的不足。
10. 常見(jiàn)問(wèn)題
10.1 背景高
| 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|
| 阻塞緩沖區(qū)不足或不適當(dāng) | 優(yōu)化阻塞效果，選擇正確的阻塞緩沖區(qū) |
| 抗體孵育濃度過(guò)高、孵育時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或溫度過(guò)高 | 調(diào)整抗體孵育濃度和孵育時(shí)間 |
| 清洗不足 | 增加洗滌次數(shù)，延長(zhǎng)洗滌時(shí)間 |
| 二抗非特異性結(jié)合 | 設(shè)置二抗的控制項(xiàng)，選擇合適的二抗 |
| 膜干燥 | 操作時(shí)保持膜濕潤(rùn) |
| 膜被污染 | 操作時(shí)保持膜的清潔，不要用手按壓 |
| 過(guò)量的化學(xué)發(fā)光底物殘留物 | 瀝干多余的化學(xué)發(fā)光液體，然后顯影 |
| 膠片曝光時(shí)間太長(zhǎng) | 多次檢查以確定適合的曝光時(shí)間 |
10.2 無(wú)目標(biāo)波段
| 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|
| 樣品中的靶蛋白豐度較低，或根本不表達(dá) | 再次確認(rèn)檢測(cè)樣品的可行性，在檢測(cè)前富集目標(biāo)蛋白的豐度。 |
| 提取過(guò)程中蛋白質(zhì)的降解 | 在蛋白提取過(guò)程中，低溫保存蛋白，加入蛋白酶抑制劑 |
| 蛋白質(zhì)樣品的儲(chǔ)存條件不正確，導(dǎo)致蛋白質(zhì)降解。 | 建議將蛋白質(zhì)樣品用SDS熱變性后保存。有價(jià)值的樣品建議保存在-80℃。 |
| 蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率低 | 采用Ponceau確認(rèn)傳輸系統(tǒng)是否正常。 |
| 抗體孵育濃度過(guò)低，或孵育時(shí)間過(guò)短 | 優(yōu)化抗體孵育量，一抗推薦4℃孵育過(guò)夜 |
| 一抗和二抗不相容 | 選擇正確的一抗和二抗 |
| 抗體滅活了 | 妥善儲(chǔ)存抗體 |
| 顯影液可能過(guò)期了 | 使用新鮮的顯影液，并防止光線照射。 |
10.3 觀測(cè)波段大小與預(yù)測(cè)波段大小不匹配
| 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|
| 標(biāo)記器顯示的尺寸有偏差 | 選擇合適的預(yù)漬標(biāo)記，觀察與未預(yù)漬標(biāo)記的區(qū)別 |
| 電泳系統(tǒng)的影響 | 為避免邊緣孔的不穩(wěn)定因素，將樣品裝入中間孔，并在邊緣孔電泳平衡系統(tǒng)中加入等量的上樣緩沖液。 |
| 翻譯后修飾 | 通過(guò)查閱文獻(xiàn)來(lái)確認(rèn)蛋白質(zhì)是磷酸化還是糖基化，等等。 |
| 翻譯后剪切和異構(gòu)體。 | 查閱文獻(xiàn)，看看這種蛋白質(zhì)是否有多種剪接活性形式。 |
| 蛋白質(zhì)聚合物的形成 | 在樣品制備過(guò)程中，使用新鮮的DTT或β-巰基乙醇保持蛋白質(zhì)單體狀態(tài)。 |
| 蛋白質(zhì)電荷的相對(duì)變化 | 蛋白質(zhì)的氨基酸組成不同，部分蛋白質(zhì)的電荷沒(méi)有wan全被帶負(fù)電荷的SDS覆蓋，導(dǎo)致蛋白質(zhì)遷移速率與蛋白質(zhì)大小不成正比。 |
10.4 其他問(wèn)題
| 可能原因 | 解決方案 |
|---|---|
| 膜上可見(jiàn)反射或黃色帶 | 一抗或二抗?jié)舛冗^(guò)高，或上樣量過(guò)多，導(dǎo)致酶被瞬間消耗 |
| 白色空白點(diǎn) | 跨膜夾層中有氣泡殘留，或抗體孵育不均勻，應(yīng)振蕩孵育。 |
| 背景上的黑點(diǎn) | 阻斷緩沖殘留物的顆粒，使用前請(qǐng)充分?jǐn)嚢枞芙?/td> |
| “微笑”條帶 | 遷移速度過(guò)快，運(yùn)行凝膠時(shí)降低電壓。 凝膠凝固不均勻，應(yīng)正確配制。 |
| “皺眉”帶 | 電泳時(shí)，襯底可能聚集大量氣泡，容易導(dǎo)致電壓不平衡，最終形成“皺眉”帶 。 |
| 涂抹帶 | 樣品中含有不溶物，建議離心或優(yōu)化蛋白質(zhì)提取。 樣品超載，請(qǐng)減少每條通道的蛋白質(zhì)負(fù)荷。 凝膠的濃度不合適，蛋白質(zhì)的分辨率低。我們建議調(diào)整交聯(lián)劑的比例。 電泳緩沖液可能重復(fù)使用，請(qǐng)更換新鮮的電泳緩沖液。 |
| 畸變帶 | 凝膠表面不均勻或制備不均勻。 樣品中鹽離子濃度過(guò)高，影響了電泳。 電壓過(guò)高，導(dǎo)致遷移快。 |
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