ELISA把酶化學(xué)反應(yīng)的敏感性與抗原抗體反應(yīng)特異性合二為一，但實驗做的再漂亮，可能一條“歪”的標(biāo)準(zhǔn)曲線就讓數(shù)據(jù)翻車了。接下來我們就用3分鐘，將標(biāo)準(zhǔn)曲線這條“紅線”掰扯透徹。

「ELISA問診室」將為大家解答標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)的常見問題。

一、合格的標(biāo)曲長啥樣？

標(biāo)準(zhǔn)曲線是ELISA實驗的核心，判斷數(shù)據(jù)可靠性的一道關(guān)卡。標(biāo)準(zhǔn)曲線是用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作出來的“參考線”，是計算樣本濃度的基礎(chǔ)。

該怎么判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線是否符合要求呢？

首先看R²值是否符合要求。

R²值（R-squared，也稱為決定系數(shù)）是衡量標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合優(yōu)度的重要指標(biāo)。R2值范圍從0到1。越接近1，說明標(biāo)曲與實驗數(shù)據(jù)之間的吻合度越高，擬合效果越好。在ELISA實驗中，要求R²值≥0.99，確保標(biāo)曲線性關(guān)系良好，結(jié)果可靠。如果低于0.95就可能存在加樣不準(zhǔn)、標(biāo)準(zhǔn)品失效、洗板不干凈等問題。 

其次看標(biāo)準(zhǔn)品OD值梯度變化是否明顯。

標(biāo)準(zhǔn)品的OD值應(yīng)按照濃度從高到低依次下降。如果某個濃度的OD值與上一濃度持平或下降太多，可能是操作失誤。

第三看空白對照OD值是否滿足足夠低。

空白對照的OD值一般應(yīng)小于0.1。如果空白值偏高，可能是清洗不凈或者試劑濃度使用偏高，需要調(diào)整配比。

最后看實驗設(shè)計是否有復(fù)孔。

ELISA實驗要做復(fù)孔（一般2-3孔），兩孔之間的差異用變異系數(shù)CV值評定。如果某個樣品的復(fù)孔OD值一個天一個地，很可能是孔內(nèi)有氣泡、樣品中有雜質(zhì)或者槍頭堵了。

二、看似合理的數(shù)據(jù)，也可能是個“坑”！

比如假陽性，明明不該有數(shù)值卻測出來了，原因可能是樣品中有干擾物質(zhì)（溶血、脂血）、非特異性結(jié)合、封閉不徹-底，可以對樣品進(jìn)行稀釋或更換封閉液。同理如果出現(xiàn)假陰性，則需要對樣品進(jìn)行濃縮、更換高靈敏度試劑盒或查看抗體有效期。

OD值并不是越高越好。如果樣品的OD值“爆表”了，超過標(biāo)曲最-高點，算出來的濃度是不準(zhǔn)確的，需要將樣品進(jìn)行稀釋重測。當(dāng)然，OD值趨于0也說明目的蛋白濃度太低，可能低于檢測下限，可嘗試對樣品進(jìn)行濃縮處理。

三、標(biāo)曲崩了，先查這三種原因！

標(biāo)準(zhǔn)品可以看作是一系列已知目標(biāo)蛋白濃度的陽性對照。如果能夠看到標(biāo)準(zhǔn)品的信號，且其濃度降低時信號也會減弱，說明ELISA檢測正常有效。反之，則需要調(diào)整ELISA的操作和檢查試劑了。比如空白孔OD值＞0.1，可能是有一定的背景存在。

標(biāo)準(zhǔn)曲線無梯度或梯度不明顯、讀數(shù)過低或過高，可能由多種因素相關(guān)，比如標(biāo)準(zhǔn)品稀釋不準(zhǔn)確、加樣或試劑操作不規(guī)范、洗滌操作不充分、交叉污染等等。具體分為以下幾種情況：

1、標(biāo)準(zhǔn)品相關(guān)

主要存在的問題有標(biāo)準(zhǔn)品復(fù)溶不當(dāng)、稀釋配置錯誤、降解。

大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品為凍干粉，在復(fù)溶時要嚴(yán)格按照說明書要求，使用指定的溶劑復(fù)溶。復(fù)溶后適當(dāng)渦旋或靜置一段時間，確保樣品全部溶解。在倍比稀釋時，要做好記錄和標(biāo)記。如有必要，可對移液器進(jìn)行校準(zhǔn)。避免反復(fù)凍融、長時間暴露在高溫或不穩(wěn)定環(huán)境中，小量分裝再保存也是常規(guī)操作，請勿粗心大意。

 2、實驗操作因素

可能存在的問題有移液不準(zhǔn)、溫育時間或溫度不合適、洗板不充分、洗劑緩沖液污染等。

移液器需要定期校準(zhǔn)，并確保移液器和槍頭之間的高度密合性，加樣時保持槍頭垂直，緩慢加樣，避免與孔壁接觸。加樣時避免液體濺出，造成孔間交叉污染。孵育應(yīng)選用精準(zhǔn)控溫的設(shè)備，比如放在避光、無風(fēng)的專用孵育箱。

3、試劑或儀器問題

可能涉及這些試劑或設(shè)備：酶標(biāo)記物、底物、酶標(biāo)儀等。

酶標(biāo)記物保存不當(dāng)、過期或受到污染，導(dǎo)致活性降低，影響顯色反應(yīng)，應(yīng)在使用前檢查其保質(zhì)期和活性，發(fā)現(xiàn)異常及時更換。底物溶液也可能會存在同樣的問題，應(yīng)使用新鮮配制的底物溶液，并避光保存。酶標(biāo)儀需定期校準(zhǔn)和維護(hù)，選擇合適的波長和檢測范圍進(jìn)行OD值讀數(shù)。

以上是ELISA操作翻車的常見情景，建議ELISA操作時定要詳細(xì)閱讀說明書，各種試劑做好平衡，稀釋液要充分溶解混勻。另外對標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置復(fù)孔，可以更好的減少誤差和繪制更佳的擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線。

標(biāo)準(zhǔn)品采用倍比稀釋法，濃度梯度至少有5個且有比較大的跨度，要涵蓋所檢測樣品的范圍（上限和下限）。在檢測標(biāo)準(zhǔn)品OD值時，應(yīng)按濃度遞增順序進(jìn)行，以減少高濃度對低濃度的影響，提高準(zhǔn)確性。

最后，為大家準(zhǔn)備了一個ELISA結(jié)果自查快速表（打印出來貼冰箱上）