MDC1（Mediator of DNA Damage Checkpoint 1）是DNA損傷應(yīng)答（DDR）通路中的關(guān)鍵支架蛋白，在組蛋白H2AX Ser?139磷酸化（γH2AX）信號(hào)放大及下游檢查點(diǎn)激活過程中發(fā)揮核心作用。該抗體A300-051A經(jīng)抗原親和純化，專一識(shí)別人類MDC1蛋白第475–525位氨基酸區(qū)域，適用于免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB）。特別是其WB稀釋范圍高達(dá)1:10,000–1:25,000，展示了j高的靈敏度和特異性。本文將從由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗MDC1抗體親和純化抗體（貨號(hào)：A300-051A）規(guī)格、免疫原設(shè)計(jì)、優(yōu)化實(shí)驗(yàn)方案、分子功能及疑難排除等方面提供完整的技術(shù)參考。

一、產(chǎn)品基本規(guī)格與儲(chǔ)存信息

參數(shù)| 內(nèi)容

靶標(biāo)| MDC1（NFBD1）

反應(yīng)性| 人類

應(yīng)用| IP、WB

宿主/克隆| 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原| 位于第475至525位氨基酸之間

亞型| IgG

標(biāo)記物| 未標(biāo)記

純度| 抗原親和純化

抗原種屬| 人類

濃度| 1000 µg/ml（1 mg/ml）

保存條件| 2?–?8?°C

有效期| 自收貨之日起 1 年

緩沖液| Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含 0.09% 疊d化鈉

> 關(guān)鍵儲(chǔ)存提示：  

> - 始終保存于 2–8?°C，切勿冷凍；冷凍會(huì)導(dǎo)致抗體聚集和效價(jià)衰減。  

> - 疊d化鈉為防腐劑，可能會(huì)抑制辣根過氧化物酶（HRP）活性。若計(jì)劃將抗體用于活細(xì)胞成像或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，需通過脫鹽柱或透析去除。  

> - 濃度采用比爾定律標(biāo)定（A280?=?1.4 對(duì)應(yīng) 1?mg/mL IgG），用戶可根據(jù)此值進(jìn)行精確稀釋。

二、推薦應(yīng)用與實(shí)驗(yàn)條件

免疫印跡（Western Blot, WB）

推薦稀釋范圍：1:10,000 – 1:25,000（j高稀釋度，充分體現(xiàn)抗體高親和力與低背景）  

凝膠建議：3?8% Tris?乙酸酯凝膠（Tris?acetate gel），更適合檢測 MDC1 約 220–250?kDa 的大分子量。  

封閉液與抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 過夜（或室溫 2?3 小時(shí)，但過夜信號(hào)更強(qiáng)）  

二抗推薦：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120?101P）  

檢測方式：增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光（ECL），建議使用高靈敏度底物（如 SuperSignal West Dura）。

WB 優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程

1. 樣本制備：  

推薦陽性對(duì)照：HeLa、HEK293、U2OS 或其它人類細(xì)胞系全裂解液。  

裂解緩沖液：RIPA（50?mM Tris?HCl pH?7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 0.5% 脫氧膽酸鈉, 0.1% SDS）添加蛋白酶抑制劑（PMSF +  cocktail）。  

上樣量：20–40?μg 總蛋白（MDC1 為中等豐度蛋白，過量上樣可能造成拖尾）。

2. 電泳：  

使用 3?8% Tris?乙酸酯預(yù)制膠或自配膠。  

電泳緩沖液：Tris?乙酸酯 SDS 運(yùn)行緩沖液。  

電壓：150?V 恒壓，約 60?80 分鐘。

3. 轉(zhuǎn)印：  

推薦 PVDF 膜（0.45?μm），甲醇活化后轉(zhuǎn)印。  

轉(zhuǎn)印條件：30?V 恒壓，4?°C 過夜（或 250?mA 恒流，120 分鐘）。  

可使用麗春紅染色確認(rèn)轉(zhuǎn)印效率及分子量位置。

4. 封閉：  

5% 脫脂牛奶 / TBST，室溫?fù)u動(dòng) 1 小時(shí)。

5. 一抗孵育：  

用 5% 牛奶 / TBST 將抗體稀釋至 1:10,000 – 1:25,000（s次實(shí)驗(yàn)建議從 1:10,000 開始）。  4?°C 輕搖過夜（16?18 小時(shí)）。

6. 洗滌：  

TBST 洗滌 4 次，每次 8 分鐘。

7. 二抗孵育：  

用 5% 牛奶 / TBST 稀釋 HRP?山羊抗兔二抗（如 1:10,000）。  

室溫孵育 1 小時(shí)。

8. 再次洗滌（同步驟 6），ECL 檢測。

> 性能預(yù)期：在合適條件下，應(yīng)在約 220–250?kDa 處檢測到單一條帶。若在 200?kDa 以下出現(xiàn)多條帶，可能是蛋白降解或非特異性結(jié)合；建議增加蛋白酶抑制劑并適當(dāng)提高一抗稀釋度。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

用量：6?μg 抗體 / mg 總蛋白裂解液  

樣本要求：使用非變性裂解緩沖液（如 50?mM Tris pH?7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 不含 SDS，添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。  

推薦對(duì)照：使用同型兔 IgG 作為陰性對(duì)照（針對(duì)非特異性結(jié)合）。

IP 詳細(xì)步驟

1. 裂解：  

收集細(xì)胞（約 5–10 × 10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分鐘。  

4?°C，12,000?×g 離心 15 分鐘，取上清。

2. 預(yù)清除（可選）：  

加入 20?μL Protein?A/G 磁珠（或瓊脂糖珠），4?°C 旋轉(zhuǎn) 1 小時(shí)，取上清。

3. 抗體結(jié)合：  

測定裂解液蛋白濃度（BCA 法）。  

取 1?mg 總蛋白，加入 6?μg A300-051A 抗體。  

4?°C 旋轉(zhuǎn)孵育 2 小時(shí)或過夜。

4. 捕獲免疫復(fù)合物：  

加入 30?μL Protein?A 磁珠，4?°C 繼續(xù)旋轉(zhuǎn) 1?–?2 小時(shí)。

5. 洗滌：  

用 IP 裂解液洗滌磁珠 4 次（每次 500?μL，4?°C，磁力架分離）。

6. 洗脫：  

加入 30?μL 2× SDS 上樣緩沖液（含 DTT），95?°C 加熱 10 分鐘。  

取上清進(jìn)行 SDS?PAGE 及 WB 檢測。

IP 后 WB 的特殊注意事項(xiàng)

由于免疫沉淀洗脫液中存在抗體輕鏈（≈25?kDa）和重鏈（≈55?kDa），而 MDC1 分子量為 220?kDa（遠(yuǎn)高于重鏈），理論上常規(guī)二抗（抗兔 IgG H+L）不會(huì)產(chǎn)生干擾。但仍建議使用 抗兔 IgG 輕鏈特異性 HRP 二抗，并在封閉液中添加 5% 正常豬血清（貨號(hào) S100?020），以c底消除殘余重鏈信號(hào)的可能性。