在腫瘤微環(huán)境研究中，成纖維細(xì)胞活化蛋白（Fibroblast Activation Protein, FAP）正成為一個(gè)備受關(guān)注的治療靶點(diǎn)。FAP是一種II型跨膜絲氨酸蛋白酶，屬于二肽基肽酶（DPP）亞家族，在正常成人組織中表達(dá)極低，但在多種實(shí)體瘤（包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、胰腺癌和宮頸癌）的癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）表面顯著上調(diào)。FAP通過(guò)切割PEDF、血管生成素-1和VEGF-C等基質(zhì)蛋白，同時(shí)上調(diào)TGF-β，從而塑造免疫抑制性微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。研究表明，敲除FAP可減少胰腺導(dǎo)管腺癌的轉(zhuǎn)移。此外，F(xiàn)AP獨(dú)特的表達(dá)譜使其成為小分子抑制劑和CAR-T細(xì)胞療法的理想靶點(diǎn)，多項(xiàng)臨床前及臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行中。因此，開(kāi)發(fā)能夠高效檢測(cè)FAP蛋白酶活性并篩選其抑制劑的工具，對(duì)于抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。

由艾美捷代理的BPS Bioscience推出的FAP Fluorogenic Assay Kit（貨號(hào)：80210），正是為滿足上述需求而設(shè)計(jì)的一套完整熒光檢測(cè)解決方案。該試劑盒采用熒光底物法，可快速、靈敏地定量FAP的蛋白酶活性，適用于酶動(dòng)力學(xué)研究、小分子抑制劑篩選及高通量篩選（HTS）。以下從檢測(cè)原理、試劑盒組分、操作流程、應(yīng)用場(chǎng)景及性能特點(diǎn)等方面進(jìn)行詳細(xì)介紹。

圖1：測(cè)定原理示意圖。

熒光DPP底物1是一種熒光肽底物（Ala-Pro-AMC二肽）。在共軛形式下，熒光染料AMC發(fā)出的能量被猝滅。蛋白水解作用會(huì)釋放AMC并發(fā)出熒光。熒光的增加與FAP活性直接成正比。

一、檢測(cè)原理：熒光底物法實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)蛋白酶活性

本試劑盒的核心檢測(cè)原理基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）或直接熒光釋放機(jī)制：

熒光底物：試劑盒提供一種針對(duì)DPP家族（尤其是FAP）優(yōu)化的熒光底物。該底物由一個(gè)短肽序列（通常為Z-Gly-Pro-AMC或類似結(jié)構(gòu)）共價(jià)連接熒光基團(tuán)（如7-氨基-4-甲基x豆素，AMC）組成。在天然狀態(tài)下，肽段與熒光基團(tuán)的連接導(dǎo)致熒光淬滅或發(fā)射波長(zhǎng)偏移。

酶切反應(yīng)：當(dāng)加入含有FAP的樣品后，F(xiàn)AP特異性切割肽段中脯氨酸之后的酰胺鍵，釋放出游離的熒光基團(tuán)AMC。

熒光檢測(cè)：游離AMC在激發(fā)波長(zhǎng)約380 nm、發(fā)射波長(zhǎng)約460 nm處產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光信號(hào)。熒光強(qiáng)度隨時(shí)間線性增加，其速率（RFU/min）直接反映FAP的蛋白酶活性。

抑制劑評(píng)估：若體系中加入FAP抑制劑，酶活性被抑制，熒光生成速率下降。通過(guò)對(duì)比抑制劑組與對(duì)照組（DMSO或無(wú)抑制劑）的初始速率，計(jì)算抑制率及IC??。

這一檢測(cè)模式具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：均相（無(wú)需分離步驟）、實(shí)時(shí)（可動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程）、高靈敏度（檢測(cè)下限可達(dá)納摩爾級(jí)）以及高通量兼容（96孔板格式適配自動(dòng)化酶標(biāo)儀）。

二、試劑盒組分與規(guī)格

該試劑盒為96孔板格式，包含足夠進(jìn)行100次酶反應(yīng)的全部核心組分：

重組人FAP酶（氨基酸29-760）：包含完整的胞外催化結(jié)構(gòu)域，經(jīng)純化及活性驗(yàn)證，確保批次間一致性。

DPP熒光底物：即用型溶液，對(duì)光敏感，需避光保存。

DPP檢測(cè)緩沖液：經(jīng)優(yōu)化的pH及離子強(qiáng)度，維持FAP的最佳催化活性。

詳細(xì)操作說(shuō)明書(shū)：包含推薦的反應(yīng)體系、酶稀釋方案及數(shù)據(jù)分析方法。

所有組分在收貨后按指示存儲(chǔ)（建議-80°C），自收貨之日起6個(gè)月內(nèi)保持最佳性能。熒光底物應(yīng)避免反復(fù)凍融及長(zhǎng)時(shí)間光照，建議分裝后于-20°C避光保存。

三、應(yīng)用場(chǎng)景

本試劑盒主要面向以下三類核心應(yīng)用：

1. 小分子抑制劑的篩選與IC50測(cè)定

在抗腫瘤藥物發(fā)現(xiàn)項(xiàng)目中，研究者可使用該試劑盒對(duì)化合物庫(kù)進(jìn)行高通量篩選，快速識(shí)別具有FAP抑制活性的先導(dǎo)化合物。由于檢測(cè)體系簡(jiǎn)單、成本適中，適合作為初篩方法。對(duì)于陽(yáng)性化合物，可進(jìn)一步進(jìn)行劑量-響應(yīng)曲線分析，獲得IC??值，用于構(gòu)效關(guān)系研究。

2. 酶動(dòng)力學(xué)研究

通過(guò)改變底物濃度（固定酶量）測(cè)定不同條件下的反應(yīng)速率，可計(jì)算FAP的米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率。同樣，改變酶濃度可驗(yàn)證線性范圍。這些參數(shù)對(duì)于理解FAP的催化機(jī)制及不同突變體的功能差異具有重要意義。

3. 抗體或生物制劑的阻斷活性評(píng)價(jià)

除小分子外，該試劑盒也可用于評(píng)估抗FAP抗體或基于蛋白質(zhì)的抑制劑是否能夠阻斷FAP的蛋白酶活性。只需將抗體與FAP預(yù)孵育，然后按標(biāo)準(zhǔn)流程加入底物即可。

四、性能特點(diǎn)與注意事項(xiàng)

線性范圍：在優(yōu)化的酶濃度（如1 nM FAP）和底物濃度下，反應(yīng)可在30–60分鐘內(nèi)保持線性，確保速率計(jì)算的準(zhǔn)確性。

Z'因子：在384孔板格式（若用戶自行轉(zhuǎn)換）下，該檢測(cè)體系通常Z' > 0.6，適合高通量篩選。

背景控制：設(shè)置無(wú)酶對(duì)照孔以扣除底物自發(fā)水解產(chǎn)生的背景熒光。同時(shí)建議設(shè)置無(wú)底物對(duì)照，評(píng)估樣品自身熒光。

抑制劑干擾排除：某些化合物可能在380/460 nm處有自發(fā)熒光或吸收，導(dǎo)致假陽(yáng)性/假陰性。建議設(shè)置“抑制劑+底物（無(wú)酶）"對(duì)照，并在數(shù)據(jù)分析時(shí)進(jìn)行校正。

底物特異性：該試劑盒使用的DPP底物可被FAP以及同家族成員DPP4、DPP8、DPP9等切割。若需驗(yàn)證抑制劑的FAP選擇性，建議使用重組單一酶進(jìn)行平行比較。

五、存儲(chǔ)穩(wěn)定性與運(yùn)輸條件

試劑盒采用-80°C干冰運(yùn)輸。收貨后，F(xiàn)AP酶和熒光底物應(yīng)立即存放于-80°C，檢測(cè)緩沖液可于-20°C或4°C短期保存（以說(shuō)明書(shū)為準(zhǔn)）。避免反復(fù)凍融：建議將酶分裝為單次使用量（例如10 uL/管），底物按需分裝。在正確存儲(chǔ)條件下，所有組分自收貨之日起6個(gè)月內(nèi)性能穩(wěn)定。

六、文獻(xiàn)參考

Pure E. and Blomberg R., 2018, Oncogene 37: 4343-4357.
Bughda R., et al., 2021, Immunotargets Ther. 10:313-323.