人多能干細胞（hPSCs），包括人胚胎干細胞（ESCs）和人誘導多能干細胞（iPSCs），在藥物研發(fā)和疾病以及組織發(fā)育研究中的應用逐漸增多。人多能干細胞（hPSCs）的一個重要特點是它們能夠分化成幾乎任何類型的細胞，包括心肌細胞。之前的研究表明，源自干細胞的心肌細胞具有與人原始心臟組織相似的特性和功能屬性。單層定向分化，結合小分子化合物和明確定義的培養(yǎng)基，已經提高了以相對高純度（>80%）產生心肌細胞的效率，而無需額外的生長因子。然而，分化效率的變異和低重復性仍然存在問題，這些問題已被歸因于初始接種密度、細胞密度和分化過程中使用的化合物的批次變異等。此外，人胚胎干細胞（hESC）和人誘導多能干細胞（hiPSC）系列中的內部和間部克隆變異，如基因和蛋白質表達、DNA甲基化和分化潛力的差異，對分化效率產生重大影響。

2020年10月28日挪威卑爾根大學臨床醫(yī)學系LaurenceA. Bindof團隊在scientific reports上發(fā)表了文章A method for differentiating human induced pluripotent stem cells toward functional cardiomyocytes in 96?well microplates該研究在96孔板中使用明確定義的培養(yǎng)基和小分子化合物進行心肌細胞分化。與較大的培養(yǎng)板相比，96孔板提供了更多的重復實驗機會，從而增加了重復性的潛力，同時仍然具有經濟高效的特點。

由于分化產量受到人胚胎干細胞（hESCs）/人誘導多能干細胞（hiPSCs）的質量、基質膠、培養(yǎng)基、小分子、細胞密度和細胞匯合度的影響，我們在96孔板中評估了這些因素。我們使用了兩種hESC系（H1和H9）和兩種hiPSC系：Detroit 551-A和AG05836B-151。為了考慮所采用的重編程方法可能存在的潛在差異，我們使用了一個通過逆轉錄病毒重編程的細胞系（Detroit 551-A）和一個無整合仙臺病毒重編程的細胞系（AG05836B-15）。此外，我們分別將傳代基質膠和培養(yǎng)基更改為Geltrex和Essential 8 Medium（E8）。（圖1A）顯示了分化的時間線和所使用的培養(yǎng)基和小分子，以及心肌細胞發(fā)育標志物和克隆形態(tài)（圖1B）。

圖1.心肌細胞誘導分化時間線

我們對細胞密度的研究表明，當分化起始時的細胞密度分別為30-40％、60-70％和80-90％時，60-70％的細胞密度在分化第15天（D15）產生了功能性心肌細胞百分比最高的培養(yǎng)物（圖2）。然后，我們估算了在細胞接種后至少2天內覆蓋60-70％孔板面積所需的細胞密度。接種包括將hPSC集落溶解成單細胞懸浮液和/或小團塊，其中含有兩到六個細胞，使用E8培養(yǎng)基，并添加Y27632。在這種組合下，細胞在37°C下孵育過夜，24小時后將培養(yǎng)基更換為新鮮的E8培養(yǎng)基。因此，估算接種密度需要至少2天的培養(yǎng)時間，以為細胞恢復和達到所需的細胞密度提供足夠的時間。我們確定，對于hESCs和hiPSCs，2.4×104個細胞/cm2的密度對于在分化第7天和第9-10天的大面積心肌細胞的跳動區(qū)域是最佳的。在這些實驗中使用的細胞系在2-3天內的細胞性為60-70％，然而，其他細胞系的最佳細胞性的時間可能會有所不同。此外，我們還注意到，如果不調整小分子CHIR99021的濃度，細胞性的任何偏差都會導致細胞死亡增加或分化效率降低。我們發(fā)現(xiàn)，對于hESCs來說，8μM的濃度是最佳的，而對于hiPSCs，6μM的CHIR99021在D15時產生了高水平的TNNT2+細胞。

hESCs/hiPSCs在無線飼養(yǎng)條件下在Essential 8培養(yǎng)基（E8）中以每平方厘米2.4×104個細胞的密度傳代在Geltrex上。在3天內，它們達到了60-70％的細胞性，這是通過以依賴于細胞濃度的方式應用GSK3抑制劑CHIR99021誘導分化的理想時間點。WNT蛋白抑制劑-2（IWP2）在誘導分化后的72小時后添加，持續(xù)48小時。第5天提供新的培養(yǎng)基（不含胰島素的RPMI/B-27），從第7天開始，每隔兩天用新的RPMI/B-27（含胰島素）培養(yǎng)細胞（圖1）。我們觀察到在第7天出現(xiàn)了跳動的心肌細胞區(qū)域，而在第9-10天，可以在孔板的大面積區(qū)域看到自發(fā)的收縮。自第10-15天收集了可收縮的心肌細胞以供進一步分析。

圖2.細胞融合度對心肌細胞分化的影響

為了評估整個分化過程中的發(fā)育標志。從hPSC向心臟譜系的分化涉及到原始褶皺樣群體的形成，從中發(fā)育出所有內胚層和中胚層譜系，包括心血管祖細胞，如心肌細胞、內皮細胞和平滑肌細胞。為確保分化遵循正確的發(fā)育路線，我們在時間點上監(jiān)測了關鍵標志物的表達水平，這些時間點對應于特定階段的轉變，包括多能狀態(tài)（D0）、生殖層特異性（D3）、前體狀態(tài)（D5）和心肌細胞（D15）在ES系H1（圖3）。如預期，使用CHIR99021處理hPSC導致了多能性基因NANOG和POU5F1的表達下降，并且在分化的D3時出現(xiàn)早期中胚層標志物，如MESP1、MIXL1和T的高水平（圖3，附圖S2和S3A）。H1和Detroit 551-A的進一步分化是由D5上ISL1和TEMEM88表達的增加來定義的，而心肌細胞的分化則由特定標志物（如TBX5、TNNT2、MYH6和MYL7）來定義（圖3，附圖S2和S3A）?；虮磉_層面顯示，當細胞從生殖層特異性（D3）向心肌細胞（D15）發(fā)展時，GATA4和ATP2A2的表達逐漸增加，心臟特異性標志物TNNT2和MYL7的表達與成熟和收縮活動相吻合（圖3，附圖S2和S3A）。這些研究還顯示了MYL2（心室肌細胞的標志物），從第12天開始存在（附圖S3A）。

為確保我們看到的是適當?shù)某墒欤覀冄芯苛顺墒煨募〖毎麡酥疚铮ㄈ鏗OPX和MYH7）在分化的較晚階段，即D30。我們表明HOPX和MYH7在分化的D30時增加，而MYH6下降（附圖S4）。

圖3.通過基因表達鑒定H1來源的心肌細胞

我們對hPSC進行了多能性評估，并在分化開始之前的hPSC（第0天）中發(fā)現(xiàn)POU5F1的表達，但沒有TNNT2心肌細胞標志物的證據(jù)。在分化過程的第7天，我們觀察到POU5F1的表達顯著減少，并出現(xiàn)了心肌細胞標志物TNNT2（附圖S3B）。接下來，我們通過評估ISL1和NKX2-5的表達來評估心臟譜系的細胞，這些基因定義了心臟前體階段。我們發(fā)現(xiàn)在分化的第6天有ISL1和NKX2-5陽性細胞（圖4A），而在第10天可以強有力地檢測到TNNT2（圖4A）。使用MYL7抗體染色，這是心房肌細胞的特異標志物，顯示了分化第10-12天內的細胞中存在心肌肌節(jié)（圖4B-ii）。此外，我們在分化第10-12天內的TNNT2+細胞中發(fā)現(xiàn)了Connexin 43（GJA1）的表達，這是縫隙連接標志物（圖4B-iii）。MYL7和心肌細胞特異性標志物肌鈣蛋白I3（TNNI3）的共染色（圖4B-iv）證實了在分化第10-12天的培養(yǎng)中存在已承諾的心肌細胞。

圖4.心肌細胞表征

在心臟譜系分化期間形成的主要細胞類型包括心肌細胞、平滑肌細胞和內皮細胞。在分化后期（第12-19天）對心肌細胞的標志物（TNNT2和MYL7）進行共染色顯示，H1培養(yǎng)的細胞中82±7%和60±10%呈陽性，而Detroit551-A培養(yǎng)的細胞中85.7±3%呈TNNT2陽性，79.7±3%呈MYL7陽性（圖5A）。根據(jù)流式細胞術的結果，H9的分化效率低，TNNT2陽性細胞為47±13%，MYL7陽性細胞為45%。然后，我們在第15天為心肌細胞染色，使用CDH5（內皮譜系標志物）和ACTA2（平滑?。酥疚?。這項分析確認了平滑肌和內皮細胞的存在，這些細胞在心臟譜系分化期間預計會成為副產物（圖5C）。

我們使用流式細胞術在第15天研究了心臟培養(yǎng)中內皮和平滑肌細胞的相對比例。表面標志物CD144和CD140b分別用于鑒定內皮和平滑肌。同時，來自同一96孔板的樣本用心肌細胞標志物TNNT2染色，以估計心肌細胞的數(shù)量（圖5B）。在H1來源的心肌細胞培養(yǎng)中，74.5±8%為TNNT2陽性細胞，9.5±2.94%染有平滑肌標志物（CD140b），只有3.71±0.81%的細胞表達內皮標志物（CD144）（圖5B）。在Detroit 551-A培養(yǎng)中，TNNT2陽性細胞比例為77±0.18%，CD140b陽性細胞比例為18.45±0.1%，內皮細胞比例為5.53±0.02%。在AG05836B-15培養(yǎng)中，67.2±0.2%為TNNT2陽性細胞，而21±0.1%和2±0.007%的細胞分別為CD140b和CD144標志物陽性（圖5B）。

圖5.使用流式細胞術分析驗證心肌細胞分化

為了研究孔間的異質性，我們從多個孔中提取了RNA，并進行了qPCR以評估相對于一個內參基因GAPDH的TNNT2和NKX2-5的表達。我們隨機選擇了12分化孔，使用MagMAx分離試劑盒提取總RNA。我們觀察了H1的兩次分化試驗，第一次分析了一個板的12個孔，而在第二次試驗中，我們分析了3個不同板的多個孔。我們還從Detroit 551-A分化的心肌細胞分別提取了3個不同板上多個孔的RNA。這些數(shù)據(jù)在在線附表S1中顯示。變異性如圖6所示，我們計算了這些CT值之間的變異系數(shù)，變異系數(shù)在1.96%和7.30%之間變化，確認了每個孔中的心肌細胞數(shù)量相似。

圖6. 96孔板中不同分化過程中的孔間異質性研究

心臟功能，包括節(jié)奏性和收縮性，依賴于多種離子通道的表達，如鈉、鉀和鈣通道。為了測試分化的心肌細胞是否具有適當?shù)碾娚硖匦裕覀儾捎昧宋㈦姌O陣列（MEA）并使用不同的心臟藥物對它們進行挑戰(zhàn)。微電極陣列提供了一種高度敏感的、非侵入性的方法，用于研究電活性細胞的生理特性。MEA記錄了稱為細胞外場電位（FPs）的電波信號，這些信號是由心肌細胞的單層或小簇產生和塑造的。FP輪廓代表心臟動作電位，并在某種程度上反映了心電圖記錄。通常情況下，人們會看到與Na+流入（R/Q峰）和膜去極化相對應的迅速上升部分，一種被認為對應于Ca2+流入的慢波/臺段，以及與主要的K+流出（T峰）相對應的復極化階段（圖7A）。

我們在分化的第11-13天將H1和Detroit551-A衍生的心肌細胞轉移到MEA倉，并在接下來的14天內（分化的第12-26天）監(jiān)測其穩(wěn)定性和心跳一致性特征。觀察期的選擇基于先前的研究，這些研究表明將心肌細胞轉移到MEA倉以檢查它們的電生理活動的最佳分化階段是第11-13天。

H1衍生的心肌細胞顯示了平均FP持續(xù)時間為298±20毫秒，心跳間隔（BI）為42±2次/分鐘，而Detroit551-A衍生的心肌細胞則顯示了平均FP持續(xù)時間為75±5毫秒，BI為49±4次/分鐘。隨著培養(yǎng)的時間延長，心跳間隔變得更加不規(guī)則，這如先前所述。為了測試hPSC衍生的心肌細胞的功能，我們應用了以下藥物：β1和β2腎上腺素能受體激動劑異丙腎上腺素（1 µM）、鉀通道拮抗劑E4031（1µM）、鈉通道拮抗劑（TTX，5 µM）、L-型鈣通道拮抗劑硝苯地平（5nM）以及5-羥色胺（血清素）受體-HT4激動劑和HT3拮抗劑Mosapride（350nM）（圖7Biv）。盡管Detroit 551-A應用的藥物較少，但這些細胞在應用異丙腎上腺素和E4031后表現(xiàn)出相同的電生理模式改變。

正如預期的那樣，異丙腎上腺素增加了心跳頻率，并顯著減少了FP持續(xù)時間（FPD，圖7Bi，表1）。如預期，E4031降低了FP幅度（FPA，圖7Bii，表1），但與其他報告相反，我們觀察到FP持續(xù)時間（FPD）增加并輕微延長了心跳間隔5,24。應用TTX導致了正峰幅度（pPA）顯著降低，增加了FPA，延長了BI，但對FPD沒有影響（圖7Biii）。硝苯地平的行為與描述一致，降低了pPA和FPD，但對BI沒有影響（圖7Biv）。Mosapride影響了FPA，并顯著降低了FPA/FPD比率，也稱為場電位幅度上升速度（FPUS），這是鈉和L型鈣通道功能的指標。

圖7.hiPSC來源的心肌細胞的MEA記錄

總之，本研究改進了將人多能干細胞誘導分化為功能性心肌細胞的方案，將其適應到96孔板中。由此產生的心肌細胞在轉錄和蛋白水平上表達心臟特異性標志物，并具有電生理特性，證實了功能性心肌細胞的存在。

https://www.nature。。ｃｏｍ/articles/s41598-020-73656-2

?；锔杉毎鹋苹|膠是一種可溶性的基底膜基質膠，這種基質是通過基因編輯技術將多種表達膠原蛋白的基因序列插入到經永生化處理的小鼠腫瘤細胞體系中，并在實體腫瘤中抽提出來的。它的主要成分是層粘連蛋白，接著是膠原蛋白IV、硫酸乙酰肝素蛋白多糖和巢蛋白?；啄せ|也含有轉化生長因子β、表皮生長因子、類胰島素生長因子、成纖維細胞生長因子和在腫瘤中自然出現(xiàn)的其他生長因子。

干細胞金牌基質膠信息表

類器官專用基礎培養(yǎng)基信息表

O27信息表