PEG脂質鏈長對體內蛋白表達、免疫應答及不良反應的影響
研究評估了不同鏈長PEG脂質（PEG1k-DMG、PEG2k-DMG、PEG5k-DMG）對mRNA-LNP疫苗在體內蛋白表達的影響。實驗結果顯示，在注射后6小時和24小時，不同鏈長PEG脂質修飾的LNP在脛骨前?。═A）、引流淋巴結（dLN）、脾臟和肝臟中的熒光素酶（FLuc）活性無顯著差異。這表明PEG鏈長的變化在短期內對mRNA在體內的表達位置和水平影響不大（圖2B, C）。
進一步分析表明，縮短PEG鏈長顯著增強了抗原特異性免疫應答。具體而言，與PEG2k-LNP相比，PEG1k-LNP在第二次免疫后第14天和第28天誘導了更高的S蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖2D）。同時，PEG1k-LNP還顯著增加了S蛋白特異性CD8+ T細胞的數(shù)量（圖2F）。這些結果表明，縮短PEG鏈長能夠增強mRNA-LNP疫苗的免疫原性。
Figure 2. Effect of chain length of PEG on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs.
不良反應評估顯示，與PEG2k-LNP相比，PEG1k-LNP在注射后6小時誘導了更高水平的炎癥細胞因子（如IFN-α、IFN-β、TNF-α、IL-6等）（圖3A）。這些結果提示，縮短PEG鏈長雖然增強了免疫應答，但也增加了疫苗的反應原性。
Figure 3. Effect of chain length of PEG on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.
PEG脂質摩爾比對體內蛋白表達、免疫應答及不良反應的影響
研究還評估了不同PEG脂質摩爾比（0%、0.5%、1.5%）對mRNA-LNP疫苗體內蛋白表達的影響。實驗結果顯示，在注射后6小時和24小時，不同PEG脂質摩爾比的LNP在各組織中的FLuc活性無顯著差異（圖4B, C）。這表明PEG脂質摩爾比的變化在短期內對mRNA體內表達的影響較小。
免疫應答分析表明，降低PEG脂質摩爾比顯著增強了抗原特異性免疫應答。與1.5% PEG-LNP相比，0%和0.5% PEG-LNP在第二次免疫后誘導了更高的S蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖4D）。同時，0%和0.5% PEG-LNP還顯著增加了S蛋白特異性CD8+ T細胞的數(shù)量（圖4F）。這些結果表明，降低PEG脂質摩爾比能夠增強mRNA-LNP疫苗的免疫原性。
Figure 4. Effect of molar ratio of PEG-lipid on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs.
不良反應評估顯示，與1.5% PEG-LNP相比，0%和0.5% PEG-LNP在注射后6小時誘導的炎癥細胞因子水平顯著降低（圖5A）。值得注意的是，0% PEG-LNP雖然不誘導抗PEG抗體產(chǎn)生，但其顆粒穩(wěn)定性較差，這可能限制了其臨床應用。
Figure 5. Effect of molar ratio of PEG-lipid on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.
膽固醇類似物替代對體內蛋白表達、免疫應答及不良反應的影響
研究評估了用植物甾醇（豆甾醇、β-谷甾醇、菜籽甾醇）替代膽固醇對mRNA-LNP疫苗體內蛋白表達的影響。實驗結果顯示，在注射后6小時和24小時，不同膽固醇類似物修飾的LNP在各組織中的FLuc活性無顯著差異（圖6B, C）。這表明膽固醇類似物的替代在短期內對mRNA體內表達的影響較小。
免疫應答分析表明，膽固醇類似物替代誘導了與膽固醇LNP相似的抗原特異性免疫應答。具體而言，豆甾醇-LNP和β-谷甾醇-LNP在第二次免疫后誘導了與膽固醇-LNP相當?shù)腟蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖6D）。同時，這些膽固醇類似物-LNP也誘導了相似水平的S蛋白特異性CD8+ T細胞反應（圖6F）。
Figure 6. Effect of replacement of cholesterol with naturally occurring cholesterol analogs on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs
不良反應評估顯示，與膽固醇-LNP相比，豆甾醇-LNP和β-谷甾醇-LNP在注射后6小時誘導的炎癥細胞因子水平顯著降低（圖7A）。同時，豆甾醇-LNP組小鼠的體溫升高也顯著減少（圖7B）。這些結果提示，膽固醇類似物的替代能夠降低mRNA-LNP疫苗的反應原性。
Figure 7. Effect of replacement of cholesterol with naturally occurring cholesterol analogs on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.
研究評估了用DOPC或DOPE替代DSPC對mRNA-LNP疫苗體內蛋白表達的影響。實驗結果顯示，在注射后6小時，DOPC-LNP在引流淋巴結、脾臟和肝臟中的FLuc活性降低，而DOPE-LNP僅在引流淋巴結中的活性降低（圖8B）。在注射后24小時，DOPC-LNP在脛骨前肌、脾臟和肝臟中的FLuc活性也降低（圖8C）。這些結果表明，磷脂替代可能影響mRNA在體內的分布和表達。
免疫應答分析表明，磷脂替代誘導了與DSPC-LNP相似的抗原特異性免疫應答。具體而言，DOPC-LNP和DOPE-LNP在第二次免疫后誘導了與DSPC-LNP相當?shù)腟蛋白特異性IgG、IgG1和IgG2b抗體水平（圖8D）。同時，這些磷脂替代-LNP也誘導了相似水平的S蛋白特異性CD8+ T細胞反應（圖8F）。這些結果表明，磷脂替代能夠在不顯著降低免疫原性的情況下進行。
Figure 8. Effect of replacement of phospholipid on in vivo protein expression and immune responses induced by mRNA-LNPs. (A-i) Chemical structures of DSPC, DOPC, and DOPE.
不良反應評估顯示，與DSPC-LNP相比，DOPC-LNP和DOPE-LNP在注射后6小時誘導的炎癥細胞因子水平顯著降低（圖9A）。同時，這些磷脂替代-LNP組小鼠的體溫升高也顯著減少（圖9B）。這些結果提示，磷脂替代能夠降低mRNA-LNP疫苗的反應原性。
Figure 9. Effect of replacement of phospholipid on inflammatory cytokine production and adverse reactions induced by mRNA-LNPs.
蛋白表達與免疫反應的正相關：分析顯示，脾臟中的FLuc（熒光素酶）表達水平與S特異性IgG抗體的產(chǎn)生、S特異性CD8+T細胞誘導之間存在顯著的正相關。這意味著，當mRNA-LNP在脾臟中表達較高水平的蛋白時，機體產(chǎn)生的特異性抗體和T細胞反應也更強。
蛋白表達與不良反應的正相關：脾臟中的FLuc表達水平還與發(fā)熱反應顯著正相關。
這表明，脾臟中較高的蛋白表達水平可能伴隨著更強的免疫激活，從而引發(fā)更明顯的發(fā)熱反應。其他器官蛋白表達與免疫反應和不良反應的無顯著相關。
與脾臟不同，其他器官（如注射部位、引流淋巴結、肝臟）中的FLuc表達水平與S特異性IgG產(chǎn)生、S特異性CD8+T細胞誘導、發(fā)熱及體重變化之間無顯著相關性。
Figure 10. Correlation between in vivo protein expression and immune responses and adverse reactions.
