本文摘要：本應(yīng)用筆記提供了無(wú)細(xì)胞蛋白表達(dá)的詳細(xì)案例，展示了輔因子、氧化還原調(diào)節(jié)劑和分子伴侶對(duì)目標(biāo)蛋白純化產(chǎn)量及活性具有顯著影響。這些案例表明，在表達(dá)過(guò)程中添加此類(lèi)物質(zhì)對(duì)于提高蛋白純化產(chǎn)量或獲得有活性蛋白十分重要，也證實(shí)了它們?cè)诘鞍踪|(zhì)折疊與功能發(fā)揮中的重要作用。
eProtein Discovery提供一套即用型添加劑組合，包含10種不同的添加劑試劑。我們已通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這些添加劑與無(wú)細(xì)胞核心試劑的兼容性。該系統(tǒng)允許每種混合物最多定制兩種添加劑，進(jìn)而可生成多達(dá)55種獨(dú)特的無(wú)細(xì)胞混合物。在一輪eProtein Discovery無(wú)細(xì)胞蛋白系統(tǒng)的篩選實(shí)驗(yàn)中，24種eGene構(gòu)建體可與8種不同的無(wú)細(xì)胞混合物進(jìn)行篩選組合，在24小時(shí)內(nèi)生成192種獨(dú)特的表達(dá)條件。借助該系統(tǒng)，用戶能夠快速確定是否需要添加輔因子、分子伴侶或氧化還原調(diào)節(jié)劑，以獲得正確折疊的蛋白質(zhì)、提高最終蛋白產(chǎn)量或增強(qiáng)蛋白活性。
圖1展示了利用不同無(wú)細(xì)胞混合物進(jìn)行蛋白表達(dá)，隨后開(kāi)展純化與活性篩選的完整流程。通過(guò)在混合物中添加輔因子、分子伴侶和氧化還原調(diào)節(jié)劑構(gòu)建多種組合，這一設(shè)計(jì)凸顯了這些物質(zhì)對(duì)蛋白純化效率及所表達(dá)蛋白酶活性的影響。
圖1：無(wú)細(xì)胞技術(shù)利用獨(dú)特?zé)o細(xì)胞混合物（CFB，Cell-free Blend）進(jìn)行蛋白表達(dá)，隨后開(kāi)展蛋白純化與篩選的工作流程。
本實(shí)驗(yàn)所用模型蛋白均在添加了輔因子、分子伴侶和氧化還原調(diào)節(jié)劑的無(wú)細(xì)胞混合物中表達(dá)，以此驗(yàn)證添加劑對(duì)后續(xù)蛋白純化產(chǎn)量及酶活性的影響。
我們精心挑選了10種添加劑納入eProtein Discovery添加劑組合中，這些添加劑對(duì)保障蛋白質(zhì)正確折疊及維持活性十分重要。表1匯總了各添加劑選項(xiàng)及其對(duì)蛋白質(zhì)折疊的益處。這份全面的添加劑清單涵蓋了大多數(shù)蛋白表達(dá)需求，既包括營(yíng)造有利于二硫鍵形成的環(huán)境，也包括添加分子伴侶、輔因子或金屬離子等額外成分以促進(jìn)蛋白正確折疊。此外，通過(guò)添加 3C 蛋白酶，還可實(shí)現(xiàn)對(duì)可溶性標(biāo)簽去除效果的評(píng)估。
表1：添加劑選項(xiàng)及其在蛋白表達(dá)中的益處。
在開(kāi)展實(shí)驗(yàn)前，用戶需考慮目標(biāo)蛋白可能存在的需求，以及為獲得正確折疊、可溶解的蛋白質(zhì)所需添加的添加劑。用戶可參考圖 2 中的決策樹(shù)，以此為指引選擇合適的添加劑。
圖2：指導(dǎo)用戶選擇添加劑的決策樹(shù)。每種表達(dá)用無(wú)細(xì)胞混合物中最多可添加兩種添加劑。
所提供的案例可用于指導(dǎo)用戶根據(jù)自身獨(dú)特的蛋白表達(dá)需求選擇添加劑，進(jìn)而快速制備高質(zhì)量、可溶解且具有活性的蛋白質(zhì)，以滿足下游應(yīng)用需求。
據(jù)估計(jì)，生物體中 25%-50% 的蛋白質(zhì)都含有金屬離子。這些金屬蛋白承擔(dān)著多種關(guān)鍵生理功能，包括呼吸作用、光合作用、DNA 合成，甚至蛋白質(zhì)合成本身。與蛋白質(zhì)結(jié)合的金屬離子發(fā)揮著基礎(chǔ)的結(jié)構(gòu)支撐、調(diào)控及酶學(xué)作用，對(duì)蛋白質(zhì)的正確折疊與功能發(fā)揮至關(guān)重要。在所有酶中，16% 的酶會(huì)結(jié)合鋅離子，使其成為常用的金屬離子輔因子。
嗜熱菌蛋白酶是一種熱穩(wěn)定的鋅金屬蛋白酶，由嗜熱蛋白分解芽孢桿菌分泌產(chǎn)生。該酶的應(yīng)用場(chǎng)景較多：可用于人工甜味劑阿斯巴甜的生產(chǎn)，在肽圖分析中用作非特異性蛋白酶，同時(shí)也是抗高血壓藥物研發(fā)過(guò)程中的重要作用機(jī)制模型。鋅離子是嗜熱菌蛋白酶發(fā)揮催化活性的必需物質(zhì)，此外該酶還能結(jié)合四個(gè)鈣離子，這些鈣離子被認(rèn)為有助于增強(qiáng)其熱穩(wěn)定性。
研究人員使用Nuclera的eGene制備試劑盒構(gòu)建了線性、無(wú)標(biāo)簽的嗜熱菌蛋白酶表達(dá)構(gòu)建體，并結(jié)合Nuclera的篩選和放大試劑盒，分別在不同條件下表達(dá)嗜熱菌蛋白酶。為了單獨(dú)分析這些金屬離子在表達(dá)階段的作用，所有實(shí)驗(yàn)組的蛋白純化過(guò)程均未添加金屬離子添加劑（圖 3A）。
通過(guò)熒光蛋白酶活性測(cè)定法檢測(cè)各純化蛋白的活性：蛋白酶催化熒光標(biāo)記的蛋白底物水解后，會(huì)解除底物的熒光淬滅狀態(tài)，產(chǎn)生的熒光信號(hào)強(qiáng)度與蛋白酶活性呈直接正相關(guān)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與已發(fā)表文獻(xiàn)一致：嗜熱菌蛋白酶的活性依賴于表達(dá)過(guò)程中鋅離子的存在，而與鈣離子無(wú)關(guān)（圖 3B）；即使將鈣離子與鋅離子聯(lián)合添加，也未觀察到酶活性的進(jìn)一步提升，這可能是因?yàn)閷?shí)驗(yàn)未設(shè)置高溫條件對(duì)酶進(jìn)行熱應(yīng)激挑戰(zhàn)。這些結(jié)果證實(shí)，在表達(dá)階段添加鋅離子對(duì)于制備具有活性的鋅金屬蛋白酶十分重要。
圖3：有無(wú)鋅離子存在時(shí)所表達(dá)嗜熱菌蛋白酶的活性對(duì)比。
（A）嗜熱菌蛋白酶在4組不同表達(dá)條件下進(jìn)行，隨后所有蛋白均在相同條件下進(jìn)行活性檢測(cè)。（B）熒光蛋白酶活性測(cè)定結(jié)果：展示了在上述指定添加劑存在下表達(dá)后，純化嗜熱菌蛋白酶的活性水平。所有活性檢測(cè)反應(yīng)均使用了等量的各蛋白樣品。
為進(jìn)一步探究金屬離子添加劑對(duì)蛋白質(zhì)折疊環(huán)境的定制化調(diào)控作用，我們分析了Mn2?對(duì)人精氨酸酶-1（ARG1）的影響。ARG1是一種同源三聚體錳結(jié)合金屬酶，參與精氨酸代謝過(guò)程，該酶缺乏會(huì)導(dǎo)致高精氨酸血癥。研究人員構(gòu)建了無(wú)標(biāo)簽和 SUMO 標(biāo)簽的ARG1線性表達(dá)構(gòu)建體，并分別在不同條件下進(jìn)行表達(dá)（圖 4A）。
蛋白純化后，通過(guò)精氨酸酶活性測(cè)定法檢測(cè)其活性：ARG1催化反應(yīng)生成尿素，尿素引發(fā)的顏色變化程度與酶活性呈正相關(guān)?；钚詸z測(cè)結(jié)果顯示，在表達(dá)過(guò)程中添加Mn2?可顯著提高純化后酶的活性（圖 4B）。
圖4：含Mn2?的無(wú)細(xì)胞混合物是ARG1獲得活性的必需條件。
（A）ARG1 eGene 構(gòu)建體分別在4組不同的條件下表達(dá)，所有蛋白均在相同條件下進(jìn)行活性檢測(cè)。（B）比色法活性測(cè)定結(jié)果：展示了純化后ARG1的活性水平。在含Mn2?條件下表達(dá)的 ARG1，其活性是在不含Mn2?無(wú)細(xì)胞混合物中表達(dá)的ARG1的5倍。
除金屬離子外，小分子有機(jī)化合物也可作為蛋白質(zhì)輔因子，發(fā)揮關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)支撐與功能調(diào)控作用。許多有機(jī)輔因子來(lái)源于維生素，例如磷酸吡哆醛（PLP）是維生素 B6 的活性形式，參與胺類(lèi)物質(zhì)及氨基酸代謝中的多種反應(yīng)。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）、乙酰輔酶 A（Acetyl-CoA）、黃素腺嘌呤二核苷酸（FAD）、S-腺苷甲硫氨酸（SAM）及磷酸吡哆醛（PLP）均被納入輔因子混合物中，作為 Nuclera 添加劑組合的重要組成部分。
天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AAT）長(zhǎng)期以來(lái)一直被用作研究模型蛋白，用于解析磷酸吡哆醛（PLP）依賴型酶的作用機(jī)制及其在氨基酸代謝中的功能。本研究評(píng)估了含 PLP 的 “輔因子混合物" 作為添加劑，對(duì)AAT表達(dá)及純化產(chǎn)量的影響。結(jié)果顯示，在含 PLP 的條件下表達(dá)的 AAT，其純化蛋白產(chǎn)量是不含 PLP 無(wú)細(xì)胞混合物中表達(dá)產(chǎn)物的 2 倍（圖 5A、圖 5B）。此外，通過(guò)熒光法 AAT 活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，僅在含 PLP 條件下表達(dá)的純化 AAT 具有活性（圖 5C）。這些結(jié)果證實(shí)，表達(dá)階段添加有機(jī)輔因子 PLP，對(duì)于提升 AAT 的純化產(chǎn)量及酶活性十分重要。
圖5：含PLP的無(wú)細(xì)胞混合物可提升AAT的純化產(chǎn)量與活性。
（A）AAT eGene 構(gòu)建體分別2組不同條件下表達(dá)，隨后進(jìn)行蛋白純化，所有樣品均在相同條件下進(jìn)行活性檢測(cè)。（B）不含與含PLP條件下表達(dá)的AAT純化產(chǎn)量對(duì)比。（C）熒光法活性檢測(cè)結(jié)果：展示了不含與含 PLP 條件下表達(dá)的純化 AAT 的活性水平。所有活性檢測(cè)反應(yīng)均使用了等量的各蛋白樣品。
乙醇脫氫酶 1A（ADH1A）是一種二聚體酶，依賴鋅離子（Zn2?）和煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）發(fā)揮作用，參與乙醇代謝過(guò)程。本研究分別在不同的無(wú)細(xì)胞混合物中表達(dá) ADH1A（圖 6A），并通過(guò)比色法乙醇脫氫酶活性測(cè)定法檢測(cè)各純化蛋白的活性。
結(jié)果顯示：與未定制化的無(wú)細(xì)胞混合物（對(duì)照組）相比，單獨(dú)添加Zn2?或單獨(dú)添加含 NAD 的輔因子混合物，均能提升純化后 ADH1A 的活性；但僅當(dāng)Zn2?與含 NAD 的輔因子混合物聯(lián)合添加時(shí)，才能觀察到最高的酶活性（圖 6B）。這一結(jié)果表明，將金屬離子與有機(jī)輔因子組合作為添加劑，可助力制備活性MAX的人類(lèi)蛋白。
圖6：含Zn2?與NAD的無(wú)細(xì)胞混合物是ADH1A實(shí)現(xiàn)活性MAX的必要條件。
（A）ADH1A eGene構(gòu)建體分別在4組不同的條件下表達(dá)，隨后進(jìn)行蛋白純化，所有樣品均在相同條件下完成活性檢測(cè)。（B）對(duì)不同條件下表達(dá)后純化的 ADH1A 開(kāi)展比色法活性測(cè)定。所有活性檢測(cè)反應(yīng)均使用等量的蛋白樣品。
即便在所需輔因子存在的條件下，部分蛋白質(zhì)仍易發(fā)生錯(cuò)誤折疊。在細(xì)胞內(nèi)環(huán)境中，蛋白毒性應(yīng)激與高濃度大分子物質(zhì)會(huì)破壞蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)蛋白質(zhì)聚集。分子伴侶的作用機(jī)制是短暫結(jié)合錯(cuò)誤折疊蛋白通常會(huì)暴露的疏水殘基，以此抑制蛋白聚集，并通過(guò)正確途徑主動(dòng)驅(qū)動(dòng)蛋白重折疊。
DnaK（即熱休克蛋白 70，HSP70）是一類(lèi)主要的分子伴侶，約有 9%-18% 的新合成多肽鏈會(huì)與其發(fā)生相互作用。DnaK 具有 ATP 酶活性，其功能可被協(xié)同伴侶蛋白 DnaJ 和 GrpE 激活：其中 DnaJ 通過(guò)結(jié)合目標(biāo)蛋白上的疏水區(qū)域發(fā)揮輔助作用，GrpE 則負(fù)責(zé)促進(jìn) ATP 與 ADP 的交換過(guò)程。
熒光素酶因在熱激條件下易發(fā)生聚集，且可通過(guò)生物發(fā)光法便捷檢測(cè)其正確折疊狀態(tài)與活性，長(zhǎng)期以來(lái)一直被用作研究 DnaK 等分子伴侶重折疊機(jī)制的模型蛋白。本研究將 DnaK 混合物作為添加劑，驗(yàn)證其在翻譯過(guò)程中對(duì)熒光素酶折疊的影響。
研究人員構(gòu)建了海洋橈足類(lèi)熒光素酶（GLuc）的線性表達(dá)構(gòu)建體，并分別在添加和未添加 DnaK 混合物的無(wú)細(xì)胞混合物中進(jìn)行蛋白表達(dá)（圖 7A）?；钚詸z測(cè)結(jié)果顯示：與僅添加緩沖液的對(duì)照組相比，在含 DnaK 混合物的無(wú)細(xì)胞體系中表達(dá)的 GLuc，其活性提升了 1 倍（圖 7B）。該結(jié)果證實(shí)，分子伴侶的存在可促進(jìn)蛋白質(zhì)正確折疊并提高其可溶性，進(jìn)而提升蛋白活性。
圖7：含DnaK的無(wú)細(xì)胞混合物可促進(jìn)GLuc的折疊并提升其活性。
（A）GLuc分別在不含和含DnaK的條件下進(jìn)行表達(dá)，隨后開(kāi)展蛋白純化，所有樣品均在相同條件下完成活性檢測(cè)。（B）對(duì)不同條件下表達(dá)后純化的GLuc進(jìn)行發(fā)光活性測(cè)定。所有活性檢測(cè)反應(yīng)均使用等量的蛋白樣品。
除輔因子與分子伴侶外，蛋白表達(dá)所處的氧化還原環(huán)境也會(huì)對(duì)其折疊與穩(wěn)定性產(chǎn)生顯著影響。這一點(diǎn)對(duì)于含二硫鍵的蛋白質(zhì)尤為重要，這類(lèi)蛋白質(zhì)占哺乳動(dòng)物蛋白質(zhì)總量的四分之一。
在氧化環(huán)境中（如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)），相鄰半胱氨酸殘基的巰基會(huì)被氧化，巰基中的硫原子相互反應(yīng)形成共價(jià)二硫鍵。但該反應(yīng)過(guò)程往往容易出現(xiàn)錯(cuò)誤，需要蛋白二硫鍵異構(gòu)酶（PDI）等酶類(lèi)參與重排二硫鍵，以確保其正確形成。二硫鍵的形成與正確排布，對(duì)于包括分泌酶和抗體在內(nèi)的眾多蛋白質(zhì)的正確折疊、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及功能發(fā)揮都十分重要。
GLuc含有5個(gè)二硫鍵，而這些二硫鍵是其實(shí)現(xiàn)最大生物發(fā)光活性的必需條件。因此，本研究再次選用 GLuc 作為模型蛋白，在添加了PDI與GSSG的定制化無(wú)細(xì)胞混合物中進(jìn)行表達(dá)（圖 8A）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與標(biāo)準(zhǔn)還原條件下的表達(dá)相比，單獨(dú)添加 GSSG 即可提升 GLuc 的活性；而當(dāng) GSSG 與 PDI 聯(lián)合使用時(shí)，GLuc 的活性提升幅度更為顯著（圖 8B）。這一結(jié)果表明，在蛋白翻譯過(guò)程中定制化調(diào)控氧化還原環(huán)境，可通過(guò)促進(jìn)含二硫鍵蛋白的正確折疊來(lái)提升其活性。此外，該實(shí)驗(yàn)還證實(shí)，額外補(bǔ)充 PDI 能夠確保二硫鍵的正確排布，進(jìn)而使蛋白活性達(dá)到最佳水平。
圖8：含GSSG與PDI的無(wú)細(xì)胞混合物可促進(jìn)GLuc實(shí)現(xiàn)折疊并提升活性。
（A）GLuc分別在3組不同條件下進(jìn)行表達(dá)，隨后開(kāi)展蛋白純化，所有樣品均在相同條件下完成活性檢測(cè)。（B）對(duì)不同條件下表達(dá)后純化的 GLuc 進(jìn)行發(fā)光活性測(cè)定。所有活性檢測(cè)反應(yīng)均使用等量的蛋白樣品。
Nuclera無(wú)細(xì)胞核心試劑與可定制化添加劑系統(tǒng)相結(jié)合，構(gòu)建出一套高效且靈活的蛋白表達(dá)優(yōu)化體系。借助eProtein Discovery系統(tǒng)，研究人員能夠快速篩選出更優(yōu)表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)量、高活性功能蛋白的制備，進(jìn)而有力推動(dòng)蛋白相關(guān)研究與應(yīng)用的進(jìn)程。
金屬離子（Zn2?、Mn2?等）是金屬蛋白酶活性表達(dá)的必需條件，直接影響蛋白折疊與功能；
有機(jī)輔因子（如PLP、NAD）可顯著提升目標(biāo)蛋白的純化產(chǎn)量與活性，部分蛋白需依賴輔因子實(shí)現(xiàn)功能；
分子伴侶（如DnaK混合物）能抑制蛋白聚集，促進(jìn)錯(cuò)誤折疊蛋白重折疊，提升蛋白可溶性與活性；
氧化還原調(diào)節(jié)劑（GSSG+PDI）可優(yōu)化含二硫鍵蛋白的折疊環(huán)境，確保二硫鍵正確形成，MAX蛋白活性；
添加劑組合使用（如金屬離子+有機(jī)輔因子）可實(shí)現(xiàn)蛋白活性的協(xié)同提升，滿足復(fù)雜蛋白的表達(dá)需求。
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