摘要：本文介紹歐洲REPROCELL公司與Qkine公司合作開展的一項(xiàng)研究，旨在評(píng)估Alvetex支架技術(shù)與高純度重組生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)優(yōu)化皮膚模型構(gòu)建及提升其可重復(fù)性的效果。
關(guān)鍵詞：Qkine、REPROCELL、Alvetex、TGF-β1 PLUS、KGF、全層人體皮膚等效模型、REPROSKIN、細(xì)胞外基質(zhì)、皮膚模型
注：本研究由杜倫大學(xué)、歐洲瑞博賽爾（REPROCELL）與Qkine合作研究發(fā)布
皮膚是一種復(fù)雜的多層器官，構(gòu)成一道完整屏障，抵御物理、化學(xué)及病原體侵襲。從結(jié)構(gòu)上看，皮膚主要分為兩大組織區(qū)域：表皮，主要由角質(zhì)形成細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)層上皮組織；真皮，富含細(xì)胞外基質(zhì)與成纖維細(xì)胞的支撐性結(jié)構(gòu)結(jié)締組織層[1]。
人工構(gòu)建的人體皮膚等效模型是科研、臨床及工業(yè)領(lǐng)域的重要工具。它可作為傳統(tǒng)體外二維細(xì)胞培養(yǎng)與體內(nèi)動(dòng)物模型的有效替代方案，后兩者通常難以準(zhǔn)確模擬人體解剖結(jié)構(gòu)與生理功能。依據(jù)英國(guó)國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物替代、優(yōu)化與減少研究中心（NC3Rs）及歐盟（化妝品法規(guī) EC 1223/2009）等機(jī)構(gòu)的原則與指導(dǎo)要求，臨床前化合物評(píng)價(jià)正逐步擺脫對(duì)動(dòng)物模型的依賴 [2,3]。因此，構(gòu)建具有生理相關(guān)性的模型對(duì)推動(dòng)皮膚病學(xué)研究發(fā)展很重要。然而，由于人體皮膚在細(xì)胞組成與結(jié)構(gòu)上高度復(fù)雜，想要建立穩(wěn)定、可重復(fù)且能準(zhǔn)確模擬天然組織生物學(xué)特性的體外模型具有挑戰(zhàn)性。
REPROCELL公司的Alvetex支架為構(gòu)建人工皮膚模型提供了優(yōu)質(zhì)工具，無需使用外源性合成或動(dòng)物源細(xì)胞外基質(zhì)成分。Alvetex是一種高孔隙率、惰性聚苯乙烯膜，其結(jié)構(gòu)可支持細(xì)胞自然浸潤(rùn)與增殖，并實(shí)現(xiàn)三維（3D）營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)擴(kuò)散。這一獨(dú)特結(jié)構(gòu)使真皮成纖維細(xì)胞能夠以三維方式生長(zhǎng)，從頭合成并沉積細(xì)胞外基質(zhì)，形成在結(jié)構(gòu)與生化特性上均接近天然人體皮膚的真皮等效體（DE）。
REPROCELL公司利用該技術(shù)開發(fā)了REPROSKIN產(chǎn)品：一種商業(yè)化、穩(wěn)定且可重復(fù)的全層皮膚模型。將人原代角質(zhì)形成細(xì)胞接種于真皮等效體的上表面，可在真皮 - 表皮連接處形成富含 Ⅳ 型膠原的基底膜。角質(zhì)形成細(xì)胞隨后增殖、分化、復(fù)層化并角質(zhì)化，形成具有完整結(jié)構(gòu)的多層表皮組織，包含基底層、棘層、顆粒層與角質(zhì)層，重現(xiàn)天然人體皮膚的體內(nèi)結(jié)構(gòu) [4]。為維持細(xì)胞活性、促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、分化與成熟，REPROSKIN采用專用培養(yǎng)基培養(yǎng)，并添加重組細(xì)胞因子與生長(zhǎng)因子。
Qkine是一家專注于重組蛋白生產(chǎn)的企業(yè)，其產(chǎn)品為無動(dòng)物源、高生物活性的生長(zhǎng)因子與細(xì)胞因子，其中包括目前市面的無動(dòng)物源重組轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）。Qkine生長(zhǎng)因子具備批間生物活性一致性、高純度與無菌性保障，是復(fù)雜三維組織培養(yǎng)的理想選擇。曼博生物是Qkine在中國(guó)授權(quán)提供商，如果需要?dú)g迎您咨詢QKine中國(guó)直售提供商上海曼博生物。
本文將介紹歐洲REPROCELL公司與Qkine公司合作開展的一項(xiàng)研究，旨在評(píng)估Alvetex支架技術(shù)與高純度重組生長(zhǎng)因子聯(lián)合應(yīng)用，對(duì)優(yōu)化皮膚模型構(gòu)建及提升其可重復(fù)性的效果。
置于6孔板中的12孔式Alvetex支架插入式小室，依次經(jīng)70%乙醇、無菌PBS及培養(yǎng)基（每孔10ml）清洗后，用于細(xì)胞接種。
將12孔式Alvetex支架插入式小室置于6孔板中，依次經(jīng)70%乙醇、無菌PBS及培養(yǎng)基（每孔10ml）清洗后，用于細(xì)胞接種。
將原代人真皮成纖維細(xì)胞（HDFn；第4～7代）以每孔 0.5×10?個(gè)的密度，接種于支架膜上，接種體積為100μl 維持培養(yǎng)基1；在37℃、5% CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，以促進(jìn)細(xì)胞黏附于支架。隨后將小室浸入培養(yǎng)基1（每孔10ml），繼續(xù)培養(yǎng)18天；每3～4天更換一次培養(yǎng)基。真皮等效體培養(yǎng)體系中添加Qkine TGF-β1 PLUS（轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1；Qk010），以促進(jìn)細(xì)胞從頭合成并沉積細(xì)胞外基質(zhì)。
在真皮成纖維細(xì)胞培養(yǎng)的第19天，吸去各孔培養(yǎng)基1。將原代人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞（HEKn；第4代）以每孔 1.3×10?個(gè)的密度，接種于支架小室的上表面，接種體積為200μl維持培養(yǎng)基 2；在37℃、5% CO?的飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育2小時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞黏附于真皮等效體。隨后將模型浸入培養(yǎng)基2（每孔10ml），繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。
為促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分化與分層，在角質(zhì)形成細(xì)胞接種第3天，將模型提升至氣-液界面（ALI）進(jìn)行培養(yǎng)。吸去小室基底側(cè)與頂端的培養(yǎng)基2，將每個(gè)小室轉(zhuǎn)移至 Alvetex 支架托架與深層培養(yǎng)皿（AVP015-2；AVP015-10）中，采用中位懸掛方式培養(yǎng)，每皿可放置3個(gè)模型。向模型小室的基底側(cè)加入培養(yǎng)基3（每皿30ml）。隨后繼續(xù)培養(yǎng)14天，再用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；每3～4天更換一次培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后收集樣本，用于下游分析。全層人體皮膚等效模型培養(yǎng)體系中添加Qkine KGF（角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)因子；Qk046），以維持角質(zhì)形成細(xì)胞活性并促進(jìn)其分化。
DMEM 培養(yǎng)基，添加 10%（v/v）胎牛血清、100 U/ml 青霉素 / 鏈霉素及 2 mM L-谷氨酰胺。
GibcoEpilife培養(yǎng)基（含 60 mM CaCl?），添加 1%（v/v）Gibco人角質(zhì)形成細(xì)胞生長(zhǎng)添加物（HKGS）及 100 U/ml 青霉素 / 鏈霉素。
成纖維細(xì)胞培養(yǎng)基，添加 100 μg/ml 抗壞血酸及 5 ng/ml TGF-β1 PLUS（Qkine；Qk010）。
角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，添加 100 μg/ml 抗壞血酸、140 mM CaCl?及 10 ng/ml KGF（Qkine；Qk046）。
角質(zhì)形成細(xì)胞培養(yǎng)基，添加 100 μg/ml 抗壞血酸、1.64 mM CaCl?及 10 ng/ml KGF（Qkine；Qk046）。
首先將原代人真皮成纖維細(xì)胞與 Alvetex 支架膜共培養(yǎng) 19 天，完成真皮等效體的構(gòu)建。實(shí)驗(yàn)全程添加Qkine 重組 TGF-β1 PLUS（Qk010），以支持成纖維細(xì)胞增殖及從頭合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）。H&E染色的組織學(xué)分析顯示：成纖維細(xì)胞充分浸潤(rùn)支架膜并呈均勻分布（圖 1A）。在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)，成纖維細(xì)胞均保持良好活性，并呈現(xiàn)細(xì)長(zhǎng)梭形的典型形態(tài)。
隨后將原代人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞接種于真皮等效體的上表面，繼續(xù)培養(yǎng) 16 天。H&E 染色結(jié)果證實(shí)：該真皮等效體可提供充足的力學(xué)與生化支撐，維持上層表皮組織層的形成，最終構(gòu)建出全層人體皮膚等效模型（圖 1B）。針對(duì)真皮基質(zhì)標(biāo)志物Ⅰ 型膠原（collagen-I）與纖連蛋白（fibronectin）的免疫熒光染色結(jié)果表明：經(jīng) Qkine 重組 TGF-β1 PLUS（Qk010）處理的真皮成纖維細(xì)胞，可在支架膜內(nèi)內(nèi)源性從頭合成并沉積細(xì)胞外基質(zhì)成分（圖 1C、圖 1D）。
圖1. 添加 TGF-β1 PLUS可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并助力全層皮膚等效模型中真皮-表皮結(jié)構(gòu)分區(qū)的形成。
（A）成纖維細(xì)胞培養(yǎng)前 19 天全程添加 Qkine TGF-β1 PLUS后，真皮等效體的代表性蘇木精-伊紅（H&E）顯微圖像；
（B）全層皮膚等效模型的代表性 H&E 顯微圖像；
（C、D）全層皮膚等效模型真皮層內(nèi) Ⅰ 型膠原（C，綠色）與纖連蛋白（D，綠色）的代表性免疫熒光顯微圖像，顯示大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積。細(xì)胞核用 Hoechst 33342 復(fù)染（藍(lán)色）。比例尺 = 50 μm。
為評(píng)估 Qkine TGF-β1 PLUS（Qk010）相較于其他供應(yīng)商產(chǎn)品的生物活性，我們對(duì)真皮等效體結(jié)構(gòu)內(nèi)的總膠原沉積量進(jìn)行了定量檢測(cè)。在相同添加濃度的培養(yǎng)基條件下，TGF-β1 PLUS可明顯上調(diào)人真皮成纖維細(xì)胞的膠原合成水平，并增強(qiáng)支架結(jié)構(gòu)內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）沉積（圖 2）。綜上結(jié)果表明：Qkine TGF-β1 PLUS可用于提升三維組織模型的構(gòu)建效率與質(zhì)量。
圖2. 與競(jìng)品相比，使用 TGF-β1 PLUS培養(yǎng)的真皮等效體（DE）總膠原沉積量更高。
在成纖維細(xì)胞培養(yǎng)第 19 天收集真皮等效體，通過羥脯氨酸定量法（Quickzyme, Leiden, Netherlands）測(cè)定總膠原含量。在相同濃度條件下，與使用其他品牌 TGF-β1 培養(yǎng)的模型相比，添加 Qkine TGF-β1 PLUS的模型具有更高的膠原含量。
將角質(zhì)形成細(xì)胞接種至真皮層后，模型在添加KGF（FGF-7；Qk046）的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。H&E染色結(jié)果顯示，模型成功形成多層表皮結(jié)構(gòu)，在真皮等效體上方清晰呈現(xiàn)出基底層、分化層及角質(zhì)化層的角質(zhì)形成細(xì)胞分層（圖 3A）。角蛋白 14（Keratin-14）特異性定位于基底角質(zhì)形成細(xì)胞，而角蛋白 10（Keratin-10）在基底上層細(xì)胞中高表達(dá)，進(jìn)一步證實(shí)形成了結(jié)構(gòu)規(guī)整、分化成熟的表皮組織層（圖 3B）。
圖3. 添加 KGF 可促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分層與分化。
（A）經(jīng) Qkine KGF 培養(yǎng)的全層皮膚等效模型表皮層代表性蘇木精-伊紅（H&E）顯微圖像。
（B）角蛋白 10（K10，綠色）與角蛋白 14（K14，紅色）代表性免疫熒光顯微圖像，顯示中間絲蛋白的特異性定位。細(xì)胞核用 Hoechst 33342 復(fù)染（藍(lán)色）。比例尺 = 50 μm。
在添加 KGF（FGF-7；Qk046）培養(yǎng)后，通過檢測(cè)全層皮膚模型表層的經(jīng)表皮水分流失（TEWL），客觀評(píng)估其完整屏障功能。TEWL數(shù)值與天然人體皮膚的已發(fā)表數(shù)據(jù)一致，表明該模型系統(tǒng)具有良好的生理相關(guān)性（圖 4）[5]。
圖4. 采用Qkine添加因子與生長(zhǎng)因子構(gòu)建的全層皮膚等效模型可形成完整的表皮屏障。
使用 VapoMeter 探頭（Delfin Technologies, Kuopio, Finland）在表皮層頂端表面測(cè)定經(jīng)表皮水分流失量（TEWL）。測(cè)得數(shù)值與天然人體皮膚相近。
在REPROSKIN模型構(gòu)建全程中，使用Qkine高純度、準(zhǔn)確定性的生長(zhǎng)因子進(jìn)行添加，可有效支持細(xì)胞分化與組織結(jié)構(gòu)形成。TGF-β1 PLUS可促進(jìn)真皮層構(gòu)建，而 KGF（FGF-7） 則有助于角質(zhì)形成細(xì)胞增殖與分層。
綜上，本合作研究建立了一套有價(jià)值的體外研究系統(tǒng)，可用于皮膚相關(guān)的學(xué)術(shù)研究、工業(yè)研發(fā)及商業(yè)化應(yīng)用。
QKine總部位于英國(guó)劍橋，是一家通過ISO9001:2015認(rèn)證的公司。作為蛋白質(zhì)創(chuàng)新的指引者，產(chǎn)品范圍涵蓋了多個(gè)應(yīng)用領(lǐng)域，旨在提高您研究的可重復(fù)性。QKine積極支持并創(chuàng)新于新興領(lǐng)域，如類器官和器官芯片、細(xì)胞農(nóng)業(yè)、再生醫(yī)學(xué)、合成水凝膠和生物打印等。
憑借制造流程，QKine生產(chǎn)高純度、高品質(zhì)、無動(dòng)物成分的生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子和其他復(fù)雜蛋白質(zhì)，其中約30%的產(chǎn)品目錄由獨(dú)特的產(chǎn)品組成，包括無標(biāo)簽的熱穩(wěn)定FGF-2 (FGF2-G3)，頭個(gè)無動(dòng)物、化學(xué)成分限定的TGF-β1，用于的干細(xì)胞培養(yǎng)基，以及無動(dòng)物成分的HGF (NK1)。
QKine可以通過提供批量預(yù)訂、批量訂單、定制裝瓶和質(zhì)量保證（QA ）來支持規(guī)模化和商業(yè)制造。
Qkine｜iPSC向三胚層分化系列-中胚層
Qkine iPSC：神經(jīng)系列分化試劑盒
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