Sexton人血小板裂解液nLiven PR對T細(xì)胞擴(kuò)增與TCM表型影響解析

一、前言

T細(xì)胞療法包括CAR-T和TCR-T等已成為一種高效的新型治療腫瘤尤其是血液瘤的方法。以往細(xì)胞治療的治療劑量是根據(jù)呈遞相關(guān)表面抗原的細(xì)胞總數(shù)來計(jì)算的，希望這些細(xì)胞的部分群體能夠在移植到病人體內(nèi)表現(xiàn)出持久的效應(yīng)反應(yīng)。最近的研究表明呈現(xiàn)中央記憶表型的T細(xì)胞在多種疾病模型中會提高效應(yīng)表型的療效[文獻(xiàn)1]。

如圖1所示，TCM是中央記憶型T細(xì)胞（Central Memory T cell）的簡稱，是初始T細(xì)胞（Naive T Cell）經(jīng)過抗原激活后，產(chǎn)生的具有長期記憶性的，并能夠歸巢到淋巴結(jié)接受抗原再刺激的T細(xì)胞。被激活的TCM細(xì)胞，在抗原的再次刺激之下，可繼續(xù)產(chǎn)生大量的攜帶同種抗原的克隆化的效應(yīng)記憶型T細(xì)胞。因此TCM細(xì)胞因其歸巢性、記憶性、持久性以及擴(kuò)增性等抗腫瘤的特點(diǎn)，相對于以效應(yīng)T細(xì)胞為主成分的免疫細(xì)胞治療生物制品具備一定的預(yù)防/抗腫瘤和治療腫瘤雙重作用的優(yōu)勢。

圖1 中央記憶T細(xì)胞TCM的分化由來

免疫治療用細(xì)胞體外培養(yǎng)體系尤其是培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的可持續(xù)性穩(wěn)定供應(yīng)是諸多生物醫(yī)藥企業(yè)密切關(guān)注的問題之一。細(xì)胞治療行業(yè)的迅速發(fā)展給傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)物料的傳統(tǒng)供應(yīng)鏈帶來了壓力，胎牛血清作為一種動(dòng)物衍生試劑在監(jiān)管方面存在重大問題，因此研究人員在很大程度上依賴于人類 AB血清作為一種特殊的蛋白質(zhì)、激素和細(xì)胞因子混合的補(bǔ)充來源，以此促進(jìn)T細(xì)胞制造過程中的生長。然而人AB血清除了本身原材料對于供體選擇的限制性問題，在能否保持細(xì)胞特定表型或重要特性的情況下能否比FBS更能促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用是有爭議的[文獻(xiàn)2]。

人血小板裂解液Human Platelet Lysate （hPL)是作為胎牛血清、人AB血清的替代性的培養(yǎng)基補(bǔ)充劑，hPL是將人的血小板進(jìn)一步裂解后所獲得的液體成分，其中含有多種生物活性因子（如圖2）。

圖2 血小板裂解液hPL組成成分

日立先進(jìn)治療方案公司(HCATS)和美國Sexton生物技術(shù)公司合作將人血小板裂解液nLiven PR與人AB血清(ABS)作為兩種免疫細(xì)胞治療用細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充劑在對T細(xì)胞記憶表型和細(xì)胞擴(kuò)增性能影響差異進(jìn)行了小規(guī)模評估，以期研究如何幫助細(xì)胞治療的生物醫(yī)藥企業(yè)提高細(xì)胞治療用的細(xì)胞質(zhì)量和增加細(xì)胞穩(wěn)定供應(yīng)。

二、T細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增以及TCM表型實(shí)驗(yàn)

1、hPL與ABS對細(xì)胞擴(kuò)增群體效果比較

從兩個(gè)供體獲得外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)，用CD3/CD28 T細(xì)胞激活劑后在靜態(tài)培養(yǎng)瓶條件下培養(yǎng)14天?？偟膩碚f，在培養(yǎng)第8天時(shí)總PBMCs細(xì)胞數(shù)擴(kuò)增沒有明顯變化，然而在第10天使用nLiven PR的培養(yǎng)組在兩個(gè)供體中都顯示出明顯高于ABS的擴(kuò)增效果（圖3）。并且對于第8天細(xì)胞樣本進(jìn)行的FACS分析，其中nLiven PR組中CD3+細(xì)胞亞群比例增加到98.2% ± 0.24%（供體1） 和 97.6± 0.26%（供體2），而ABS組CD3+細(xì)胞亞群比例分別為94.8%±0.63%和91.9%±1.47%。因此可初步大致判斷nLiven組相對ABS組的PBMCs總擴(kuò)增群體增加的原因是由于T細(xì)胞亞群為主擴(kuò)增的促進(jìn)。

圖3：兩名捐贈者的 PBMCs 在以 ABS 和 hPL 作為培養(yǎng)補(bǔ)充劑的擴(kuò)增對比

培養(yǎng)10天后均實(shí)現(xiàn)了統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的擴(kuò)張

2、hPL與ABS對細(xì)胞擴(kuò)增時(shí)TCM細(xì)胞亞群影響的比較

在前言中，我們已知TCM的定量化的監(jiān)測為臨床規(guī)范化治療提供參考指標(biāo)，通過細(xì)胞制劑中最終TCM亞群而不是總T細(xì)胞產(chǎn)量來評估培養(yǎng)效果提供更現(xiàn)實(shí)的治療相關(guān)性參考，因此可以說良好TCM表型的T細(xì)胞群體也是評估細(xì)胞治療制劑的產(chǎn)量有效且重要的參考方面。

一般而言TCM細(xì)胞亞群的百分比通常與細(xì)胞群體翻倍的次數(shù)呈負(fù)相關(guān)（如圖4中的ABS培養(yǎng)組），然而當(dāng)在靜態(tài)培養(yǎng)瓶中用nLiven PR培養(yǎng)時(shí)，與ABS組相比雖然實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞總產(chǎn)量相似但是該TCM亞群細(xì)胞在統(tǒng)計(jì)上有顯著增加(見圖4)，由此推斷nLiven PR條件下生產(chǎn)的高質(zhì)量、有效的TCM細(xì)胞數(shù)量更多。這也再次驗(yàn)證了實(shí)驗(yàn)1中得出的結(jié)論：無論不同的供體PBMCs中TCM的起始濃度百分比是多少，14天培養(yǎng)期結(jié)束時(shí)有大約30%的T細(xì)胞群體為TCM（起始細(xì)胞為PBMCs） ，但同樣利用ABS培養(yǎng)的 PBMCs擴(kuò)增的同時(shí)則會導(dǎo)致TCM群體顯著減少。

圖4：來自6個(gè)獨(dú)立供體實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)在靜態(tài)培養(yǎng)瓶中擴(kuò)增顯示

nLiven PR在培養(yǎng)14天后持續(xù)增加PBMCs中總的中央記憶T細(xì)胞比例

下圖5種展示的是起始細(xì)胞選用來自三個(gè)供體的CD3+陽性的細(xì)胞，在結(jié)束培養(yǎng)期時(shí)約50%的T細(xì)胞亞群為TCM。nLiven組與ABS組相比，兩名供體的PBMCs細(xì)胞培養(yǎng)后TCM細(xì)胞亞群有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的顯著增加。

圖5：三個(gè)供體的CD3+陽性的細(xì)胞用hPL和AB血清擴(kuò)增后TCM的比例

用nLiven PR培養(yǎng)的T細(xì)胞在體外擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，其TCM細(xì)胞亞群的增加結(jié)果趨勢是明確且保持一致的，這與添加AB血清培養(yǎng)獲得的T細(xì)胞包括增效果隨之而來的TCM亞群比例降低的這種現(xiàn)象即原代人T細(xì)胞擴(kuò)增的驅(qū)動(dòng)向效應(yīng)表型分化的預(yù)期相反，這表明nLiven PR的作為T細(xì)胞培養(yǎng)基補(bǔ)充劑的加入有選擇性地促進(jìn)了在整個(gè)體外培養(yǎng)過程中TCM表型的維持。

3、hPL與ABS對T細(xì)胞治療起始材料差異性影響的比較

緊接著研究人員在放大的攪拌培養(yǎng)系統(tǒng)中評估使用nLiven替代ABS作為培養(yǎng)補(bǔ)充劑的持續(xù)影響，主要操作是：對于來自三個(gè)供體的CD3+起始細(xì)胞亞群，用Dynabeads-Activator CD3/CD28 激活處理后，在攪拌式生物反應(yīng)器中培養(yǎng)11天。發(fā)現(xiàn)nLiven PR和ABS兩組的所有三個(gè)供體的平均細(xì)胞群的翻倍分別為6.1±0.58和6.0±1.37 (圖6)。因此該實(shí)驗(yàn)中nLiven和ABS兩組總T細(xì)胞群體擴(kuò)增沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著變化。然而當(dāng)關(guān)注到這三組間供體來源起始細(xì)胞群體CD3+之間的差異性，nLiven PR組的變異系數(shù)為10%，而ABS組為23%，由此表明nLiven PR組的供體間變異顯著降低，后面的實(shí)驗(yàn)也在這兩組不同供體間的對比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)nLiven血小板裂解液作為培養(yǎng)基補(bǔ)充可能會緩解因血小板捐贈供體之間差異性帶來的整體治療的差異性影響，降低起始材料的可變性，幫助開發(fā)者產(chǎn)生更好的特征治療。

圖6：3組供體來源的T細(xì)胞擴(kuò)增在ABS和hPL兩種組影響區(qū)別不大

但nLiven PR組的供體對供體變異顯著較低

如何降低批次之間的差異是開發(fā)細(xì)胞治療制品一個(gè)主要考慮因素，作為人類血小板的裂解物nLiven比富集的人AB血清在生產(chǎn)制備工藝過程中涉及生物化學(xué)物質(zhì)的更為均勻的混合。這種差異可能是帶來細(xì)胞治療用細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生更為一致反應(yīng)的原因之一。

三、結(jié)語

本次研究多個(gè)供實(shí)驗(yàn)中，nLiven PR的培養(yǎng)組中TCM表型得到促進(jìn)即在PBMCs擴(kuò)增的TCM細(xì)胞亞群顯著增加。而對于細(xì)胞制品轉(zhuǎn)化為臨床時(shí)關(guān)注的捐贈供體的一致性影響方面：與ABS相比，當(dāng)nLiven PR補(bǔ)充培養(yǎng)基進(jìn)行與商業(yè)相關(guān)的細(xì)胞培養(yǎng)擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)時(shí)，不同供體間獲得的總細(xì)胞產(chǎn)量或中央記憶表型TCM的變異水平較低。從細(xì)胞制劑中所用治療用細(xì)胞質(zhì)量的屬性，而不是細(xì)胞數(shù)量的體積來評估產(chǎn)量方面，我們可以得出：nLiven 將PR應(yīng)用到T細(xì)胞體外細(xì)胞制品的制造過程中可以獲得高質(zhì)量的治療用T細(xì)胞。

此外美國貝勒醫(yī)學(xué)院由 Norihiro Watanabe利用胎牛血清(FBS)、人AB血清(ABS)和人血小板裂解液nLiven作為培養(yǎng)基補(bǔ)充劑對T細(xì)胞記憶表型和治療療效的影響進(jìn)行了小規(guī)模評估，最終結(jié)果顯示：對比ABS和FBS，在nLiven中培養(yǎng)組實(shí)驗(yàn)中，表現(xiàn)出中央記憶表型的T細(xì)胞和總存活率在統(tǒng)計(jì)上顯著增加（圖7）[文獻(xiàn)3]。

圖7：相對于FBS和ABS，Sexton血小板裂解液T-Liven的擴(kuò)增效率更高，更有助于T細(xì)胞維持較低的分化水平狀態(tài)

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四、參考文獻(xiàn)

1.Klebanoff CA, Gattinoni L, Torabi-Parizi P et al. Central memory self/tumor-reac-tive CD8+ T cells confer superior antitumor immunity compared with effector memory T cells. PNAS 2005; 102 (27): 9571–6.

2.Manufacturing of primed mesenchymal stromal cells for therapy. Nature Biomedical Engineering,2019. 3(2): 90-104.

3.Torres Chavez A, McKenna MK, Canes?trari E et al. Expanding CAR T cells in human platelet lysate renders T cells with in vivo longevity. J. ImmunoTher. Cancer 2019; 7: 330.

本文基于Sexton公開資料由其中國直售提供商上海曼博生物整理，用于科研信息分享。上海曼博生物可提供Sexton人血小板裂解液、nLiven PR、T-Liven血小板裂解液及細(xì)胞治療培養(yǎng)基補(bǔ)充劑相關(guān)產(chǎn)品與技術(shù)支持，支持T細(xì)胞培養(yǎng)、免疫細(xì)胞治療及細(xì)胞治療工藝開發(fā)應(yīng)用。

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