豬補(bǔ)體蛋白3(C3)ELISA試劑盒操作說明

　　豬補(bǔ)體蛋白3(C3)ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法，以下是操作說明，可參考(不同品牌的產(chǎn)品請以品牌商盒子中帶說明書為準(zhǔn))：?

　　BS-4532   豬補(bǔ)體蛋白3(C3)ELISA試劑盒   96T/48T

　　一、檢測原理

　　試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，往預(yù)先包被補(bǔ)體蛋白3(C3)抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并洗滌后，用底物TMB顯色;TMB在過氧化物酶催化下轉(zhuǎn)化為藍(lán)色，最終在酸的作用下轉(zhuǎn)為黃色，顏色深淺和樣本中C3含量呈正相關(guān)，通過酶標(biāo)儀測定450nm波長的吸光度(OD值)，即可計(jì)算樣本濃度。

　　二、試劑盒組成(以96孔配置為例)

　　名稱 規(guī)格

　　微孔酶標(biāo)板 12孔×8條(已預(yù)包被抗體)

　　標(biāo)準(zhǔn)品 0.3mL×6管(濃度：0、5、10、20、40、80μg/mL)

　　樣本稀釋液 6mL

　　檢測抗體-HRP 10mL

　　20×洗滌緩沖液 25mL

　　底物A、底物B 各6mL

　　終止液 6mL

　　封板膜、自封袋、說明書 配套配置

　　三、樣本處理要求

　　血清?：使用不含熱原/內(nèi)毒素的試管，收集血液后3000轉(zhuǎn)離心10分鐘分離血清和紅細(xì)胞;也可室溫自然凝固10-20分鐘，2000-3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，沉淀需再次離心收集上清

　　血漿?：選擇EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝，3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清

　　細(xì)胞上清液?：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物后取上清;若檢測細(xì)胞內(nèi)成分，用PBS稀釋細(xì)胞懸液至100萬/ml，反復(fù)凍融破壞細(xì)胞后離心取上清

　　組織勻漿?：將組織加入生理鹽水搗碎，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清

　　保存注意?：樣本不及時(shí)檢測需按單次用量分裝凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，解凍后需確保樣本充分混勻

　　四、試劑準(zhǔn)備

　　洗滌緩沖液稀釋?：按1:20比例用蒸餾水稀釋20×洗滌緩沖液(1份濃縮洗滌液加19份蒸餾水)

　　試劑盒平衡?：從冰箱取出試劑盒，室溫平衡20分鐘后再使用;濃縮洗滌液若有結(jié)晶，水浴加熱使結(jié)晶溶解后再配置

　　五、操作步驟

　　從室溫平衡后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回2-8℃冰箱保存

　　設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔：標(biāo)準(zhǔn)品孔各加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL;樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL(最終結(jié)果需乘以5校正稀釋倍數(shù));空白孔不加樣

　　除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴/恒溫箱溫育60分鐘

　　棄去孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干;每孔加滿洗滌液，靜置1分鐘后甩去洗滌液，再次拍干，重復(fù)洗板5次(也可使用自動(dòng)洗板機(jī)完成)

　　每孔加入底物A、底物B各50μL，37℃避光孵育15分鐘

　　每孔加入終止液50μL，15分鐘內(nèi)，在酶標(biāo)儀450nm波長處測定各孔的OD值

　　六、結(jié)果計(jì)算

　　在Excel中以標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)線性回歸曲線，根據(jù)曲線方程計(jì)算各樣本的濃度值;若樣本經(jīng)稀釋，最終結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)即可得到實(shí)際濃度

　　七、注意事項(xiàng)

　　試劑盒僅用于科研實(shí)驗(yàn)

　　不同批次試劑不可混用，實(shí)驗(yàn)后剩余未使用試劑需按要求密封低溫保存

　　嚴(yán)格按照說明書規(guī)定的溫育時(shí)間、加液量操作，所有液體組分使用前需充分搖勻

　　不能檢測含NaN?的樣品，NaN?會(huì)抑制辣根過氧化物酶活性，導(dǎo)致結(jié)果偏差

　　注：以上科研耗材資料供參考!