E6AP 是一種 HECT 結(jié)構(gòu)域泛素連接酶（E3），通過泛素?蛋白酶體途徑介導底物蛋白降解。該基因母源突變導致 Angelman 綜合征（AS），同時 E6AP 可與 HPV 16/18 型 E6 蛋白結(jié)合，促進 p53 降解，參與宮頸癌發(fā)生。由艾美捷Bethyl Laboratories推出的兔抗E6AP抗體親和純化（貨號：A300-352A） 經(jīng)抗原親和純化，特異性識別 人 E6AP 蛋白第 400–450 位氨基酸 區(qū)域，適用于免疫沉淀（IP）和免疫印跡（WB），并交叉識別小鼠 E6AP。本文從產(chǎn)品規(guī)格、免疫原設(shè)計、實驗操作方案、功能背景及故障排查等方面提供系統(tǒng)技術(shù)參考。

一、產(chǎn)品基本規(guī)格與儲存信息

參數(shù)| 內(nèi)容|

靶標| E6AP / UBE3A

反應(yīng)性 | 小鼠、人類

應(yīng)用| IP、WB

宿主/克隆性 | 兔 / 多克隆

形式| 完整 IgG

免疫原 | 第400至450位氨基酸之間

亞型| IgG |

標記物 | 未標記

純度| 抗原親和純

抗原種屬 | 人類

濃度| 1000 µg/ml（1 mg/ml）

保存條件 | 2?–?8?°C

有效期 | 自收貨之日起 1 年

緩沖液 | Tris-檸檬酸/磷酸緩沖液，pH 7–8，含 0.09% 疊d化鈉

儲存與操作提示：  

抗體須始終保存于 2–8?°C，嚴禁冷凍，冷凍會導致蛋白聚集和效價下降。  

疊d化鈉作為防腐劑，可能抑制 HRP 活性；若用于活細胞或體內(nèi)實驗，需通過脫鹽柱去除。  

抗體濃度經(jīng)比爾定律標定（A280?=?1.4 對應(yīng) 1?mg/mL IgG），方便用戶精確稀釋。

二、推薦應(yīng)用與實驗條件

免疫印跡（Western Blot, WB）

推薦稀釋范圍：1:1,000 – 1:10,000（寬稀釋窗口適應(yīng)不同表達豐度樣本）  

封閉液與抗體稀釋液：5% 脫脂牛奶 / TBST  

一抗孵育：4?°C 過夜（推薦）  

二抗推薦：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

檢測方式：增強型化學發(fā)光（ECL）

WB 優(yōu)化流程

1. 樣本制備：  

陽性對照：HeLa、HEK293 或 小鼠腦組織裂解液（小鼠 E6AP 在腦高表達）。  

裂解液：RIPA 緩沖液（含蛋白酶抑制劑），E6AP 分子量約 100?kDa。  

上樣量：20–30?μg 總蛋白。

2. 電泳：使用 8% SDS?PAGE 或 4–12% 梯度膠。  

3. 轉(zhuǎn)?。篜VDF 膜，250?mA 恒流 90 分鐘。  

4. 封閉：5% 脫脂牛奶 / TBST，室溫 1 小時。  

5. 一抗孵育：用 5% 牛奶 / TBST 按 1:1,000 – 1:10,000 稀釋（s次建議 1:2,000）。  

6. 洗滌：TBST 洗滌 3?×?10 分鐘。  

7. 二抗孵育：HRP?山羊抗兔（1:10,000–1:20,000），室溫 1 小時。  

8. ECL 檢測。

預期結(jié)果：應(yīng)在約 100?kDa 處檢測到單一條帶。若出現(xiàn)多條帶（常見約 75?kDa、50?kDa），可能為降解產(chǎn)物；建議提高一抗稀釋度至 1:5,000 或 1:10,000，并確保樣本新鮮。

免疫沉淀（Immunoprecipitation, IP）

用量：6?μg 抗體 / mg 總蛋白裂解液  

裂解液要求：使用 非變性裂解緩沖液（如 50?mM Tris pH 7.4, 150?mM NaCl, 1% NP?40, 不含 SDS），添加蛋白酶抑制劑。

IP 詳細步驟

1. 細胞裂解：收集 1–2 個 10?cm 皿細胞（約 5–10?×?10?），加入 500?μL IP 裂解液，冰上裂解 30 分鐘，離心取上清。  

2. 蛋白定量：BCA 法測定裂解液濃度。  

3. 預清除（可選）：加入 20?μL Protein?A/G 磁珠，4?°C 旋轉(zhuǎn) 1 小時。  

4. 抗體結(jié)合：取 1?mg 總蛋白，加入 6?μg A300-352A 抗體，4?°C 旋轉(zhuǎn)孵育過夜。  

5. 捕獲復合物：加入 30?μL Protein?A 磁珠，繼續(xù)孵育 2 小時。  

6. 洗滌：用 IP 裂解液洗滌磁珠 4–5 次。  

7. 洗脫：加入 30?μL 2× SDS 上樣緩沖液（含 DTT），95?°C 加熱 10 分鐘。  

8. WB 檢測：取上清進行 SDS?PAGE。

IP?WB 的特殊注意事項

E6AP 分子量約 100?kDa，遠高于抗體重鏈（≈55?kDa），理論上常規(guī)抗兔 H+L 二抗不會干擾。但為確保最潔凈背景（尤其檢測低豐度互作蛋白時），仍推薦使用 抗兔 IgG 輕鏈特異性 HRP 二抗，并在封閉液中添加 5% 正常豬血清（貨號 S100?020），以c底消除重鏈信號。

IP 陽性對照：可使用已知與 E6AP 相互作用的蛋白（如 HPV E6、p53）進行共沉淀驗證。

三、該抗體的核心優(yōu)勢

人/小鼠交叉反應(yīng)性：無需分別采購不同種屬抗體，尤其適合轉(zhuǎn)基因小鼠模型及 AS 研究。  

親和純化低背景：WB 可實現(xiàn) 1:10,000 稀釋，IP 背景干凈。  

配方化 IP 用量：6?μg/mg 裂解物，避免抗體過量浪費。  

寬 WB 稀釋窗口（1:1,000–1:10,000）：適應(yīng)高表達（腫瘤細胞）和低表達（部分原代細胞）樣本。  

液態(tài)穩(wěn)定保存：2–8?°C 一年，無需分裝凍融。  

表位位于 HECT 上游：不影響識別天然構(gòu)象，可用于 IP 檢測蛋白復合物。

四、匯總信息表（快速參考）

應(yīng)用稀釋速查：  

WB：1:1,000 – 1:10,000（5% 牛奶/TBST，4?°C 過夜）  

IP：6?μg/mg 裂解物  

二抗推薦：  

WB 常規(guī)：Goat anti?Rabbit IgG (H+L) HRP（A120-101P）  

IP?WB：anti?Rabbit IgG Light Chain HRP + 5% 正常豬血清（S100?020）  

陽性對照：HeLa 細胞（人）、小鼠全腦裂解液（鼠）  

儲存：2–8?°C，嚴禁冷凍；有效期 1 年