在DNA損傷修復領(lǐng)域，PARP家族是一類關(guān)鍵的核酶，通過催化多聚ADP-核糖化（PARylation）參與DNA單鏈斷裂修復、基因組穩(wěn)定性維持及細胞應(yīng)激響應(yīng)。PARP2作為該家族的重要成員，雖然僅貢獻約10%的總PARP活性，但在DNA修復、氧化應(yīng)激應(yīng)答及線粒體片段化中發(fā)揮不可替代的作用。基因敲除研究顯示，PARP2還參與脂肪生成、精子發(fā)生及胸腺細胞存活，并作為雌激素受體（ER）和過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）的共調(diào)節(jié)因子。值得注意的是，PARP2在前列腺癌中過表達，并通過FOXA1/AR通路促進疾病進展。臨床上已獲批的PARP抑制劑（如奧拉帕尼、尼拉帕尼等）同時靶向PARP1和PARP2，但其對PARP2選擇性抑制的貢獻及潛在的治療優(yōu)勢仍在深入研究中。因此，開發(fā)能夠精準、高效檢測PARP2酶活性的分析工具，對于靶向PARP2的藥物發(fā)現(xiàn)及機制研究至關(guān)重要。

由艾美捷代理的BPS Bioscience推出的PARP2 Chemiluminescent Assay Kit（貨號：80552），正是為滿足上述需求而設(shè)計的一套完整化學發(fā)光檢測方案。該試劑盒采用基于組蛋白包被板的ELISA原理，通過檢測生物素化ADP-核糖摻入底物的量來定量PARP2的酶活性，適用于小分子抑制劑篩選、酶動力學研究及高通量篩選（HTS）。以下從檢測原理、試劑盒組分、操作流程、應(yīng)用場景及性能特點等方面進行詳細介紹。

圖1. PARP2化學發(fā)光檢測試劑盒示意圖。

組蛋白被涂覆在384孔板上。接下來，在優(yōu)化的檢測緩沖液中，將生物素化的NAD+混合物（稱為PARP底物混合物）與PARP2酶和活化的DNA模板一起孵育。然后，用鏈霉親和素-HRP處理板，隨后加入ELISA ECL底物，產(chǎn)生化學發(fā)光，可使用化學發(fā)光儀進行測量?；瘜W發(fā)光信號與PARP2活性成正比。

一、檢測原理：化學發(fā)光法定量PARP2的自身PARylation及底物PARylation

本試劑盒采用經(jīng)典的PARP酶活性ELISA檢測模式，核心原理如下：

底物包被：96孔或384孔板預先包被組蛋白或特定核蛋白作為PARP2的底物。組蛋白是PARP家族天然底物，其上的谷氨酸殘基可被PARylation修飾。

PARP2反應(yīng)：加入重組人源PARP2酶（氨基酸2-583，包含催化結(jié)構(gòu)域和DNA結(jié)合域）、生物素化NAD?（biotin-NAD?，作為ADP-核糖供體）以及含活化DNA的PARP檢測緩沖液。在DNA存在下，PARP2被激活，催化生物素化ADP-核糖單元聚合到組蛋白底物上，同時發(fā)生自身PARylation。反應(yīng)產(chǎn)物為生物素標記的PAR鏈。

檢測：洗滌去除未結(jié)合的試劑后，加入鏈霉親和素標記的辣根過氧化物酶（Streptavidin-HRP）。鏈霉親和素與生物素化PAR鏈高效結(jié)合。再次洗滌后，加入化學發(fā)光HRP底物，HRP催化產(chǎn)生光信號。發(fā)光強度與固定化PAR鏈的量呈正比，即與PARP2酶活性呈正比。

抑制劑效應(yīng)：若體系中加入PARP2抑制劑，酶活性被阻斷，生物素化PAR鏈合成減少，發(fā)光信號降低。通過比較抑制劑組與對照組（DMSO或無抑制劑）的發(fā)光值，計算抑制率及IC50。

與熒光偏振法或熒光法相比，化學發(fā)光檢測具有背景極低、信噪比高、動態(tài)范圍寬的優(yōu)勢，尤其適合需要高靈敏度的篩選應(yīng)用。同時，該方法為終點法（非實時），可批次處理大量樣品，與自動化工作站兼容良好。

二、試劑盒組分與規(guī)格

該試劑盒提供兩種規(guī)格：96孔板形式（100次反應(yīng)）和384孔板形式（400次反應(yīng)），每個試劑盒包含以下核心組分：

重組人PARP2酶（氨基酸2-583）：純化自昆蟲細胞或大腸桿菌表達系統(tǒng)，經(jīng)活性驗證，確保批次間一致性。

生物素化NAD?（biotin-NAD?）：即用型溶液，作為PARylation反應(yīng)的ADP-核糖來源。

PARP檢測緩沖液：含有活化DNA（如剪切的鮭魚精DNA）及必要的輔因子（Mg2?、DTT等），以激活PARP2并維持其催化活性。

鏈霉親和素-HRP：濃縮液，使用前需按說明書稀釋。

化學發(fā)光底物：HRP的發(fā)光底物（如魯米諾/過氧化物溶液）。

10×洗滌緩沖液：需稀釋后使用。

封閉緩沖液：用于減少非特異性結(jié)合。

詳細操作說明書：包含包被步驟、反應(yīng)條件及數(shù)據(jù)分析模板。

所有組分在收貨后按指示存儲（通常為-80°C或-20°C，具體以說明書為準），自收貨之日起6個月內(nèi)保持最佳性能。生物素化NAD?和鏈霉親和素-HRP需避免反復凍融。

三、實驗流程簡要說明

以下為典型96孔板操作流程（試劑盒通常已提供預包被組蛋白的板，或需用戶自行包被，以說明書為準）：

1. 試劑準備

從-80°C取出PARP2酶、生物素化NAD?、檢測緩沖液等，置于冰上解凍。

準備待測抑制劑：用檢測緩沖液或DMSO稀釋至所需濃度（建議設(shè)置10個濃度梯度，2倍或3倍倍比稀釋）。注意最終DMSO濃度不得超過1%（見禁忌說明）。

稀釋洗滌緩沖液至1×工作濃度。

2. 反應(yīng)體系構(gòu)建

使用提供的預包被組蛋白微孔板（若未預包被，需先用組蛋白包被過夜，然后封閉）。

每孔加入50 uL檢測緩沖液（含活化DNA）。

加入10 uL稀釋的PARP2酶（推薦起始濃度0.5–5 nM，需預實驗優(yōu)化，使信號處于線性區(qū)間）。

加入10 uL待測抑制劑或?qū)φ眨ň彌_液/DMSO/陽性對照如奧拉帕尼、他拉唑帕尼等）。

室溫預孵育10分鐘。

加入10 uL生物素化NAD?（終濃度通常為0.5–2 uM）。

用封板膜覆蓋，室溫或30°C孵育30–60分鐘（使PARylation反應(yīng)充分進行）。

3. 檢測步驟

棄去反應(yīng)液，每孔加入200 uL 1×洗滌緩沖液，洗滌3次。

加入100 uL稀釋的鏈霉親和素-HRP（按說明書比例稀釋），室溫孵育30分鐘。

再次洗滌3次。

加入100 uL化學發(fā)光底物，立即使用發(fā)光酶標儀讀取發(fā)光值（RLU），積分時間0.5–1秒。

4. 數(shù)據(jù)分析

四、應(yīng)用場景

本試劑盒主要面向以下兩大類核心應(yīng)用：

1. PARP2小分子抑制劑的篩選與IC50測定

2. 酶動力學研究與作用機制解析

五、存儲穩(wěn)定性與運輸條件

試劑盒采用-80°C干冰運輸。收貨后，PARP2酶和生物素化NAD?應(yīng)立即存放于-80°C；鏈霉親和素-HRP和化學發(fā)光底物通常存放于-20°C（避光）；檢測緩沖液和洗滌緩沖液可于4°C保存。建議將PARP2酶分裝為單次使用量（如2 uL/管），避免反復凍融。在正確存儲條件下，所有組分自收貨之日起6個月內(nèi)性能穩(wěn)定。

文獻參考：

Gui B., et al., 2019 Proc Natl Acad Sci USA 116 (29): 14573-14582.