一、產(chǎn)品概述

本試劑盒專為體外鑒定和表征小 G 蛋白（Cdc42、Rac1 和 RhoA）的鳥嘌呤核苷酸交換因子（Guanine nucleotide Exchange Factor, GEF）而設(shè)計(jì)，Rho GTPases GEF 篩選試劑盒由Cytoskeleton推出，艾美捷代理。試劑盒采用熒光檢測方法，基于純化蛋白進(jìn)行反應(yīng)，不適用于細(xì)胞裂解液。該工具可支持 GEF 活性生化表征、新型 GEF 蛋白的篩選以及 GEF 抑制劑的高通量篩選。

二、核心應(yīng)用場景

鑒定 Cdc42、Rac1 或 RhoA 的 GEF 蛋白：使用純化蛋白進(jìn)行體外測定，快速判斷目標(biāo)蛋白是否對特定 Rho GTPase 具有交換活性。

GEF 活性的生化表征：定量分析 GEF 的催化效率、底物特異性及動(dòng)力學(xué)參數(shù)。

高通量篩選 GEF 抑制劑：采用 384 孔板格式，適用于大規(guī)?；衔镂膸旌Y選，尋找靶向特定 GEF-Rho 相互作用的小分子調(diào)節(jié)劑。

三、試劑盒內(nèi)容（每盒支持 20–130 次測定，視 GTPase 種類而定）

組分 | 說明

Exchange buffer | 交換緩沖液，提供反應(yīng)所需離子環(huán)境

Cdc42-His 蛋白 | 重組 His 標(biāo)簽 Cdc42 蛋白

RhoA-His 蛋白 | 重組 His 標(biāo)簽 RhoA 蛋白

Rac1-His 蛋白 | 重組 His 標(biāo)簽 Rac1 蛋白

hDbs-His 蛋白 | 重組 His 標(biāo)簽人 Dbs 蛋白（已知 GEF，用作陽性對照）

384 孔板 | 高通量篩選用微孔板

96 孔板 | 常規(guī)檢測用微孔板

四、所需設(shè)備與材料

溫控?zé)晒庾x數(shù)儀：激發(fā)波長 485 nm ± 20 nm，發(fā)射波長 535 nm ± 20 nm。

移液器、多道移液器或自動(dòng)液體處理工作站（推薦用于高通量篩選）。

純化待測 GEF 蛋白（用戶自備）或化合物文庫（用于抑制劑篩選）。

五、檢測原理

本試劑盒基于熒光標(biāo)記的鳥嘌呤核苷酸類似物在自由狀態(tài)與結(jié)合狀態(tài)下的光譜差異。當(dāng)熒光核苷酸類似物與 Rho GTPase 結(jié)合時(shí)，熒光強(qiáng)度顯著增強(qiáng)。在待測 GEF 存在下，GTPase 加速交換結(jié)合的 GDP 為熒光核苷酸類似物，導(dǎo)致熒光信號(hào)隨時(shí)間升高。通過監(jiān)測熒光強(qiáng)度的變化速率，即可定量評估 GEF 活性。

檢測參數(shù)：

激發(fā)波長：485 nm

發(fā)射波長：535 nm

檢測時(shí)長：約 2 小時(shí)

六、生物活性測定方法（標(biāo)準(zhǔn)流程）

以下為使用已知 GEF（如 hDbs）驗(yàn)證試劑盒性能的典型步驟。用戶可根據(jù)自身待測 GEF 進(jìn)行調(diào)整。

1. 試劑準(zhǔn)備

將 Exchange buffer 平衡至室溫。

解凍各 GTPase 蛋白（Cdc42、Rac1、RhoA）和陽性對照 hDbs 蛋白，置于冰上。

準(zhǔn)備熒光核苷酸類似物（試劑盒未提供，需另行購買或按實(shí)驗(yàn)室常規(guī)配方配制）。

2. 反應(yīng)體系配制（96 孔板格式）

每孔終體積通常為 50–100 μl，包含：

1× Exchange buffer

50–100 nM 目標(biāo) GTPase

0.5–2 μM 熒光核苷酸類似物

待測 GEF 蛋白（濃度范圍：1–500 nM，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定）

陽性對照孔：加入 hDbs 蛋白（終濃度約 10–50 nM）

陰性對照孔：不加 GEF 或用 Exchange buffer 替代

3. 熒光監(jiān)測

將反應(yīng)板置于溫控?zé)晒庾x數(shù)儀中，設(shè)定激發(fā) 485 nm，發(fā)射 535 nm。

溫度控制：22°C 或 30°C（根據(jù) GEF 活性最適溫度調(diào)整）。

每 30–60 秒讀取一次熒光值，持續(xù) 1–2 小時(shí)。

4. 數(shù)據(jù)分析

計(jì)算每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的熒光強(qiáng)度變化（ΔF = F? – F?）。

對時(shí)間作圖，曲線斜率為初始交換速率。

將待測 GEF 孔的速率與陰性對照孔比較，計(jì)算相對活性。

陽性對照（hDbs）應(yīng)顯示出顯著高于背景的熒光增強(qiáng)。

七、關(guān)鍵特性總結(jié)

特性 | 描述

檢測方法 | 熒光法（Ex 485 nm / Em 535 nm）

檢測靶點(diǎn) | Cdc42、Rac1、RhoA

陽性對照 | hDbs（人 Dbs 蛋白，His 標(biāo)簽）

適用樣本 | 純化蛋白（不適用于細(xì)胞裂解液）

檢測通量 | 96 孔或 384 孔板格式

檢測時(shí)長 | 約 2 小時(shí)

主要用途 | GEF 鑒定、生化表征、抑制劑高通量篩選

八、注意事項(xiàng)與優(yōu)化建議

1. 不適用細(xì)胞裂解液：裂解液中含有核苷酸、鹽分及其他干擾物質(zhì)，會(huì)嚴(yán)重影響熒光核苷酸類似物的結(jié)合特異性，導(dǎo)致假陽性或假陰性結(jié)果。必須使用純化的待測 GEF 蛋白。

2. GTPase 預(yù)加載：部分實(shí)驗(yàn)方案建議先將 GTPase 與未標(biāo)記 GDP 孵育，以確保其處于 GDP 結(jié)合狀態(tài)，提高交換效率。本試劑盒的 Exchange buffer 已優(yōu)化，但用戶可根據(jù)經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行調(diào)整。

3. 蛋白濃度優(yōu)化：不同 GEF 的催化效率差異可達(dá) 1000 倍以上，建議對待測 GEF 進(jìn)行濃度梯度預(yù)實(shí)驗(yàn)（例如 1、10、100、500 nM）。

4. 陽性對照驗(yàn)證：s次使用試劑盒時(shí)，務(wù)必運(yùn)行 hDbs 陽性對照孔，以確認(rèn)試劑盒組分活性。hDbs 對 RhoA 和 Cdc42 均有交換活性，對 Rac1 活性較弱，可作為底物特異性參照。

5. 高通量篩選格式：使用 384 孔板時(shí)，反應(yīng)體積可縮小至 20–30 μl。推薦使用自動(dòng)液體工作站以確保加樣精度。篩選抑制劑時(shí)，先加入化合物與 GEF 預(yù)孵育 10–15 分鐘，再加入 GTPase 和熒光核苷酸類似物啟動(dòng)反應(yīng)。

6. 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化：將待測孔熒光速率與陽性對照孔（設(shè)為 100%）和陰性對照孔（設(shè)為 0%）進(jìn)行比較，計(jì)算相對活性百分比。

警告：本產(chǎn)品僅限研究使用，不適用于人類或獸醫(yī)治療。