Human MDA(Malonyldehyde) ELISA Kit
人 MDA ELISA試劑盒

尊敬的客戶，感謝你選用本公司的產(chǎn)品。本產(chǎn)品適用于體外定量檢測人血清、血漿或細胞培養(yǎng)上清液、組織等中天然和重組的MDA濃度。檢測其他特殊樣本請咨詢本公司技術支持。試劑盒僅供科研使用。使用前請仔細閱讀說明書并檢查試劑盒組分。如有疑問，請聯(lián)系及時與我們聯(lián)系。

本試劑盒采用雙抗體夾心法，雙抗體夾心原理，是基于要測試的抗原具有二價以上的特性，能識別包被抗體，同時能識別檢測抗體，具體過程如下：

（1）將特異性抗體與固相載體連接，形成固相抗體，洗滌除去未結合的抗體及雜質(zhì)，并用無關蛋白封閉空余結合位點。

（2）加受檢標本使之與固相抗體接觸反應一段時間，讓標本中的抗原與固相載體上的抗體結合，形成固相抗原復合物。洗滌除去其他未結合的物質(zhì)。

（3）加生物素標記抗體，使固相免疫復合物上的抗原與生物素標記抗體結合。洗滌未結合的生物素標記抗體。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關。

（4）加辣根過氧化物酶標記親和素，使生物素標記抗體與辣根過氧化物酶標記的親和素結合。洗滌未結合的酶標記物。此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量正相關。

（5）加入底物顯色，即可計算標本濃度。

（6）注：一個抗體分子上可以標記上若干個生物素分子，一個生物素分子可以結合一個辣根過氧化物酶標記的親和素，從而帶來了大量的辣根過氧化物酶結合到抗體上，比傳統(tǒng)的直接辣根過氧化物酶標記抗體具有更高的敏感性和放大效應。

[人 MDA酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理]：

本實驗采用雙抗體夾心ELISA法。所提供的ELISA Kit是典型的夾心法酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒（ELISA）。預先包被的抗體為抗人MDA單克隆抗體。檢測相抗體為多克隆抗體，經(jīng)生物素（biotin）標記。樣品和生物素標記抗體先后加入酶標板孔反應后，PBS或TBS洗滌。隨后加入過氧化物酶標記的親和素反應；經(jīng)過PBS或TBS的洗滌后用底物TMB顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的待測因子呈正相關。 

[人MDA酶聯(lián)免疫試劑盒檢測原理示意圖]：

[試劑盒組成]：

 [試驗所需自備試驗設備和器材]：

1. 酶標儀(450nm檢測波長濾光片，570nm或630nm校正波長濾光片)。

2. 洗板機（可調(diào)注液量，保證每孔350μl洗液而不溢出）。

3. 超凈工作臺，生物安全柜，通風柜。

4. 高精度單道加液器（量程為0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,200-1000μl).

5. 高精度多道加液器（8道或12道，量程為50-300μl).

6. 37℃恒溫箱。

7. 低溫離心機。

8. 電冰箱（4℃,-20℃,-86℃）.

9. 分析天平。

10. 剪刀，鑷子，鉗子等。

11. 漩渦混合儀，低頻振蕩器等。 

[試驗所需自備試驗耗材及試劑]：

1. 離心管（容量為1.5ml，5ml等）。

2. 一次性吸頭（量程為0.5-10μl,2-20μl,20-200μl,200-1000μl）.

3. 純凈水或蒸餾水。

4. 坐標紙。

5. 吸水紙。

6. EDTA，枸櫞酸鈉，肝素 

[標本收集注意事項]：

1. 收集血液的試管應為一次性的無熱原，無內(nèi)毒素試管。

2. 血清和血漿避免使用溶血，高血脂標本。

3. 標本應清澈透明，懸浮物應離心去除。

4. 標本收集后若不及時檢測，需按一次使用量分裝，凍存于-20℃，-80℃電冰箱內(nèi)，避免反復凍融。

5. 可根據(jù)標本的實際情況，做適當倍數(shù)稀釋(建議做預實驗，以確定稀釋倍數(shù))。

6. 收集標本，盡量做到雙份的用量，避免一次實驗失敗，重復實驗時標本缺失，從而耽誤實驗進程。

7. 收集標本時，應該做好防護措施（比如戴手套，口罩，護目鏡等），認為所有標本都具有一定的潛在危險性。

8. 樣本處理應該在生物安全柜里面，并且正確使用生物安全柜。

[標本處理辦法]：

1. 血清：將采集的全血靜置冰箱4℃過夜，然后1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。

2. 血漿：用EDTA，枸櫞酸鈉，肝素等作為抗凝劑，加入血液混勻后，1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。

3. 組織勻漿：切取組織塊，0.01MPBS中過洗一次；按照1G組織加入5-10ml組織蛋白萃取試劑的比例，在冰水中勻漿。勻漿完成后，5000-10000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。

4. 細胞培養(yǎng)上清：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃（3-6個月）保存。

5. 尿液，腹水，腦脊液等：1000-3000rpm離心10分鐘，取上清立即測試，暫時不測可以放入-20℃（1-3個月）或-80℃3-6個月）保存。 

注：樣品稀釋的一般原則

用戶須查閱相關文獻了解標本內(nèi)待測因子的含量，決定適當?shù)南♂尡稊?shù)，以使稀釋后樣品中待測因子的濃度處于ELISA試劑盒的最佳檢測范圍。樣品的稀釋應有詳細記錄。 

[注意事項]：

1．試劑盒使用前請保存在2-8℃。除復溶后的標準品，其他成分不可凍結。

2．濃縮生物素化人MDA抗體，濃縮酶結合物體積小，運輸中顛簸和可能的倒置，會使液體沾到管壁或瓶蓋。因此使用前請用手甩幾下或1000rpm離心1分鐘，以使附著管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。

3．濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，使結晶溶解后再配制洗滌液。

4．測試過程中，人MDA凍干標準品為一次性使用，不得分裝。因其濃度較低，溶解兩小時候后，會迅速失活。

5．操作嚴格按照說明書進行，本試劑不同批號組分不得混用。

6．配制試劑時，要用旋渦混合儀混勻。加入孔內(nèi)的試劑，充分混勻?qū)y試結果尤為重要，使用微量振蕩器(使用頻率)，如無微量振蕩器，可在反應前手工輕輕晃動酶標板1分鐘，例如做圓周動作，使加入孔中的反應液混勻。

7．實驗用酶標儀應嚴格按使用說明書規(guī)范操作，并在使用前充分預熱。

8．酶免試驗中人MDA標準品和樣本檢測時建議作復孔。

9．將不用的微孔板放進原鋁箔袋中，置2-8℃保存。

10．顯色液對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。

11．超過使用日期的試劑盒不能應用于實驗中。

12．試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準，使用雙波長檢測時，波長應該設置為450nm和630nm.

13．所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按生物廢棄物處理。終止液為2M硫酸，使用時必須注意安全。

14．各步驟加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校準其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。

15．每次試驗測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔最高濃度的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請乘以總稀釋倍數(shù)（×n）。

16．不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

17．以洗板機洗板時,每孔注液量不應少于350μl,注意檢查加樣頭是否堵塞。手工洗板時,用帶紙屑的吸水材料應慎重,防止外源性過氧化物酶類似物或氧化還原物與顯色劑發(fā)生反應。

18．用終止液終止反應后，請于10分鐘內(nèi)讀取OD值。

19．進行復孔實驗時，結果計算一定要求平均值。

20．標本溶血可能會有假陽性結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。

21．試驗時，應該將加過樣品的板條放于密閉盒內(nèi)，并保持濕度約60%左右。

22．為保證恒溫箱內(nèi)的溫度為37℃，恒溫箱的溫度要經(jīng)常校準。以確保實驗溫度保持恒定。

23．48T的試劑盒，所有組分均為96T的50%的量。

[檢測前準備工作]：

1.請?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫后方可進行試驗。

2.將濃縮洗滌液用雙蒸水稀釋(1:25)。未用完的放回。

3.人 MDA標準品:加入標準品稀釋液1.0ml至凍干人 MDA標準品中，靜置10分鐘，待其充分溶解后，輕輕混勻(濃度為200 ng/ml)，之后在管身標注①，然后根據(jù)需要進行稀釋。(建議標準曲線使用以下濃度：200、100、50、25、12.5、6.25、3.125ng/ml)。注意：務必要保證凍干標準品溶解和混勻。

4.標準品稀釋方法圖例：取7支潔凈的試劑管，分別標注②,③,④,⑤,⑥,⑦,⑧.每管加入300μl標準品稀釋液。從第①管內(nèi)取出300μl加入到第②管，混勻后，再從第②管取出300μl加入到第③管，以此類推至第⑦管。第⑧管為標準品稀釋液，作為陰性對照使用。

注：復溶標準品原液（200 ng/ml）請廢棄，不可重復使用。

5.生物素化人MDA抗體工作液：按當次試驗所需用量，用抗體稀釋液稀釋濃縮生物素化抗體(1:100)，配置成生物素化抗體工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。

6.酶結合物工作液：按當次試驗所需要用量，用酶結合物稀釋液稀釋濃縮酶結合物(1:100)，配置成酶結合物工作液。使用前30分鐘準備。僅供當日使用。

7.TMB顯色工作液：在使用之前30分鐘，按TMB顯色液A 9份加TMB顯色液B 1份（9：1）的比例配制TMB顯色工作液。

[洗滌方法]：

1．自動洗板機：要求注入的洗滌液為350靗，注入與吸出間隔20－30秒。確保機器運用熟練后，再投入實驗中使用。

2．手工洗板：每孔加洗滌液350靗，靜置30秒后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干。手工洗板時，注意加入洗液的過程中，不要造成孔間污染，從而出現(xiàn)跳孔的現(xiàn)象。 

[操作步驟]：

1. 從已平衡至室溫的密封袋中取出試驗所需板條，未用的板條和干燥劑請放回鋁箔袋內(nèi)封存于2-8℃。

2. 預留空白孔（若使用雙波長讀板，空白孔可以不設）。

3. 分別將標本或不同濃度人MDA標準品（0pg/ml孔加標準品稀釋液）加入相應孔中(100靗/孔)，37℃孵箱孵育90分鐘。

4. 提前30分鐘制備生物素化人MDA抗體工作液。

5. 洗板2次。

6. 加入生物素化人MDA抗體工作液(100靗/孔)。37℃孵箱孵育60分鐘。

7. 提前30分鐘制備酶結合物工作液。室溫避光放置。

8. 洗板3次。

9. 除空白孔外，加入酶結合物工作液(100μl/孔)。37℃孵箱，避光孵育30分鐘。

10. 洗板5次。

11. 加入TMB顯色工作液（包括空白孔）100μl/孔，37℃孵箱，避光孵育，當標準曲線高濃度的顏色較深，有明顯的顏色梯度的時候，即可終止。試驗顯色反應請勿超過30分鐘。

12. 加入終止液（包括空白孔）100μl/孔，混勻后即刻測量OD（450nm）值(10分鐘內(nèi))。

[操作程序總結]：

[結果判斷]：

1．每個標準品和標本的OD值應減去零孔的OD值。（若不減零孔值，標準曲線的零孔應相交于Y軸）

2．手工繪制標準曲線。以標準品濃度作橫坐標，OD值作縱坐標，以平滑線連接各標準品的坐標點。通過標本的OD值可在標準曲線上查出其濃度。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如curve expert 1.3進行結果計算。

3．若標本OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測，計算濃度時應乘以稀釋倍數(shù)。 

[參考曲線]：

注意：本圖僅供參考，應以同次試驗標準品所繪標準曲線來計算標本含量。 

試劑盒參數(shù)：

[檢測范圍]：3.125-200ng/ml

[靈敏度]：最小可測人 MDA達1.875ng/ml

[特異性]：系統(tǒng)和其它因子無交叉反應。

[批間差]：≤12%.

[批內(nèi)差]：≤8%.

[回收率]：70-110%.

[保存]：-20℃ [短期內(nèi)（如兩周）可4℃]

[用途]：用于體外定量分析液體標本（通用型）。

[規(guī)格]：96T/48T

[生產(chǎn)日期]：見酶標板鋁箔袋封口鋼印。

[保質(zhì)期]：12個月（-20℃） 

[ELISA常見問題及解決方案]: